Isolatie van primaire muisknop hepatocyten door niet-radioactieve L-azidohomoalanine Labeling methode p.a. ontluikende eiwit synthese
Summary
Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van gezonde en functionele primaire muisknop hepatocyten. Instructies voor het opsporen van hepatische ontluikende eiwitsynthese door niet-radioactieve labeling substraat werden verstrekt om te helpen begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de eiwitsynthese in het kader van de homeostase van de energie-metabolisme in de lever.
Abstract
Hepatocyten parenchymal cellen van de lever en in dienst nemen van meerdere metabole functies, met inbegrip van synthese en secretie van eiwitten essentieel voor systemische energie homeostase. Primaire hepatocyten geïsoleerd uit de lymfkliertest lever vormen een waardevolle biologische hulpmiddel om te begrijpen van de functionele eigenschappen of de veranderingen die zich voordoen in de lever. Hierin we beschrijven een methode voor het isoleren en de cultuur van de primaire muisknop hepatocyten door het uitvoeren van een tweestaps collagenase perfusie techniek en hun gebruik voor het onderzoeken van eiwit metabolisme te bespreken. De lever van een volwassen muis is sequentieel geperfundeerd met ethyleenglycol-bis Dinatriumethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing (EGTA) en collagenase, gevolgd door de isolatie van hepatocyten met de dichtheid kleurovergang buffer. Deze geïsoleerde hepatocyten levensvatbaar op cultuur platen zijn en de meerderheid van de begiftigde kenmerken van hepatocyten te handhaven. Deze hepatocyten kunnen worden gebruikt voor de beoordeling van eiwit metabolisme met inbegrip van ontluikende eiwitsynthese met niet-radioactieve reagentia. We laten zien dat de geïsoleerde hepatocyten gemakkelijk worden gecontroleerd en bestaan uit een hogere stabiliteit van de kwaliteit en het volume van eiwitsynthese gekoppeld aan energiemetabolisme door gebruik te maken van de chemo-selectieve afbinding reactie met een Tetramethylrhodamine (TAMRA) eiwit detectiemethode en westelijke bevlekkende analyses. Deze methode is daarom waardevol voor het onderzoeken van hepatische ontluikende eiwitsynthese gekoppeld aan energie homeostase. Het volgende protocol worden de materialen en methoden voor de isolatie van kwalitatief hoogwaardige primaire muisknop hepatocyten en opsporing van ontluikende eiwitsynthese.
Introduction
Eiwit is een belangrijk element van de voeding en ongeveer 50% van het drooggewicht van het menselijk lichaam is samengesteld uit eiwitten die verschillende biologische kenmerken en functies1 hebben. Bijgevolg eiwitsynthese is een van de meeste energie verbruikende gebeurtenissen en een verandering in de stofwisseling van eiwit is sterk gekoppeld aan de ontwikkeling van ziekten, met inbegrip van metabole ziekten2,3,4. In de lever, eiwit biosynthese goed voor ongeveer 20 tot 30% van de totale energie verbruik5,6. Ter vermeerdering, eiwitten functie niet alleen passief bouwen van blokken van de lever, maar ook actief signaal-bemiddelen factoren intracellulair of extracellularly te reguleren de systemische metabolisme7. Bijvoorbeeld, de lagere niveaus van serum albumine, die gesynthetiseerd en uitgescheiden door de lever en de overvloedigste eiwitten in het plasma8, verhoogt het risico van type 2 diabetes ontwikkeling9,10, 11, terwijl een hogere concentratie van serum albumine beschermend is tegen metabool syndroom12te ontwikkelen. Bovendien kan gestoord of verstoring van secretoire of membraan-gebonden hepatische eiwitten, die homeostase van cholesterol moduleren, waaronder lipoproteïnen, LDLR en LRP1, leiden tot de ontwikkeling of insulineresistentie, hyperlipidemie, atherosclerose 13. Daarom, de identificatie van moleculaire pathofysiologische mechanismen die bij eiwit verstoring van het metabolisme in de lever en de bijbehorende metabole complicaties betrokken zijn kan zinvol zijn voor het ontdekken van de roman farmacologische benaderingen om begin retard of het metabole ziektes zoals diabetes, insulineresistentie en non-alcoholische vette lever.
Eiwitsynthese is nauw gekoppeld aan de status van de cellulaire energie (b.v., de vorming van één binding van peptide tijdens de stap van de rek van de eiwitsynthese vereist 4 phosphodiester obligaties14) en wordt gereguleerd door moleculaire trajecten die zin Inter – en intra – cellular nutriënten beschikbaarheid15,16. AMP-geactiveerd proteïne kinase (AMPK) is één van de intracellulaire energie-sensoren die energie homeostase17handhaven. Zodra AMPK wordt geactiveerd wanneer de cellulaire energie niveaus lager worden, functioneren AMPK en haar gerichte substraten om te stimuleren katabole pathways en remmen anabole processen, met inbegrip van eiwit synthese18,19. De regulering van de eiwitsynthese wordt gemedieerd door fosforylering van meerdere factoren van de vertaling en ribosomal eiwitten20. Van de nota, de zoogdieren doel van rapamycin complexe 1 (mTORC1), een belangrijke bestuurder van de eiwitsynthese, is een van de hoofddoelen van AMPK21. Activering van de mTORC1-pathway verbetert de celgroei en proliferatie door stimulerende eiwit vertaling en autophagy20,21. Het is daarom logisch dat activering van AMPK mTORC1-gemedieerde eiwit synthese22kan remmen. Inderdaad, activering van AMPK tegengaat en direct kinaseenzym mTORC1 op threonine residu 2446 (Thr2446) leidt tot de inactivatie23 en onderdrukking van de proteïne biosynthese24. Bovendien kunnen AMPK niet indirect mTORC1 functie door fosforylatie en activering van Tubereuze sclerose complex 2 (TSC2)25 die de upstream regulator van mTORC1 signalering trapsgewijs remmen. Kortom, disregulatie van deze trajecten in de lever is vaak gekoppeld aan de ontwikkeling van metabole ziekten en daarom is er dringend behoefte om effectieve experimentele instrumenten voor het onderzoek naar de rol van deze trajecten in de regulering van energie en eiwit metabolisme in hepatocyten.
Er is een sterkere gelijkenis tussen de functionele eigenschappen van geïsoleerde primaire hepatocyten en in vivo hepatocyten dan met in vitro lever afkomstige cel lijnen26,27,28. Het is aangetoond dat primaire menselijke hepatocyten 77% gelijkenis met die van lever biopsieën delen, overwegende dat HepG2 cellen, die goed gedifferentieerde hepatische kankercellen en op grote schaal gebruikt om te onderzoeken van hepatische functies, vertonen die minder dan 48% in het kader van genexpressie profielen29. Daarom gebruik van primaire hepatocyten, in plaats van vereeuwigd cultuur cellen, is van vitaal belang bij het onderzoeken van hepatische functie en fysiologie, en diverse protocollen beschikbaar zijn voor de isolatie en de cultuur van primaire hepatocyten vooral van ratten30,31. Terwijl de rat hepatocyten handig met een relatief hogere opbrengst van cellen zijn, hebben muis hepatocyten een groter potentieel in vele wetenschappelijke aspecten vanwege de brede beschikbaarheid van genetisch gemoduleerde muizen. Er zijn echter verschillende technische uitdagingen in het isoleren van gezonde en overvloedige primaire hepatocyten van muizen voor cellulaire en moleculaire gebaseerde evaluaties: ten eerste, inbrengen van de canule aan het perfuse van de lever met buffer reagentia is zeer moeilijk te behandelen vanwege de kleine en dunne muis portal ader of vena cava inferior; Ten tweede, een langere tijd van de manipulatie van cellen tijdens de isolatie vermindering kan veroorzaken in cel hoeveelheid en kwaliteit; derde, niet-enzymatische mechanische scheidingsmethoden kunnen leiden tot ernstige schade en een lage opbrengst van levensvatbare geïsoleerde primaire hepatocyten32,33. In de jaren 1980, collagenase perfusie techniek geïntroduceerd voor het isoleren van hepatocyten uit de lever van de dieren34. Deze methode is gebaseerd op collagenase perfusie van de lever35,36,,37, infusie van de lever met calcium complexvormer oplossing38,39, enzymatische spijsvertering en mechanische dissociatie van de hepatische parenchym35. In de eerste stap is de lever van een muis met een calcium [Ca2 +] gratis buffer met een [Ca2 +] complexvormer (ethyleendiamine Dinatriumethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing, NA2EDTA) geperfundeerd. In de tweede stap, is de muis lever geperfundeerd met een buffer van collagenase-bevattende te hydrolyseren van de mobiele-extracellulaire matrix interacties. In tegenstelling tot de buffer die wordt gebruikt in stap 1, de aanwezigheid van [Ca2 +]-ionen in de buffer van de tweede stap is vereist voor effectieve collagenase activiteit, waarna de verteerd lever heeft verder zachtjes en mechanisch gescheiden met behulp van de verlostang tussen de hepatische capsule en parenchymateuze weefsel. Ten slotte, bindweefsel wordt verwijderd door te filteren, en latere centrifugeren scheidt levensvatbare hepatocyten uit zowel niet-parenchymal cellen en niet-levende hepatocyte met het gebruik van dichtheid kleurovergang buffer40,41 ,42. In de huidige studie tonen we een gemodificeerde tweestaps collagenase perfusie techniek te isoleren van de primaire hepatocyten uit de lever van een muis voor de analyse van de eiwitsynthese.
De radiolabeling van eiwitten wordt veel gebruikt om te kwantificeren van de expressie-niveaus, omzet tarieven, en bepalen de biologische distributie van eiwitten,43 , vanwege de hoge gevoeligheid van detectie van radioactiviteit44. Echter, vereist het gebruik van radioactieve isotopen onderzoek sterk gecontroleerde omstandigheden en procedures45. Alternatieve niet-radioactieve methoden zijn ontwikkeld en steeds meer aan populariteit hebben gewonnen. De reactie van de chemo-selectieve afbinding met een Tetramethylrhodamine (TAMRA) methode voor de detectie van de eiwitten is een van hen en is gebaseerd op de chemo-selectieve reactie tussen een azide en alkyn groepen46, die kan worden gebruikt voor het analyseren van cellulaire gebeurtenissen zoals opsporen ontluikende eiwitsynthese en subklassen van glycoproteïnen bewerkt met een azide groep. Voor ontluikende eiwitsynthese, zijn L-Azidohomoalanine (L-AHA, een aminozuur azide gemodificeerde) metabolisch opgenomen in eiwitten en opgespoord door middel van de TAMRA eiwit detectie methode47. Met behulp van deze test in primaire muisknop hepatocyten, laten we zien dat het ontluikende eiwit synthese tarief is strak gekoppeld aan de beschikbaarheid van ATP van mitochondriale en AMPK activering (Figuur 1).
Kortom, gebruik van primaire muisknop hepatocyten is cruciaal voor het onderzoeken van het metabolisme van eiwitten en energie en kwantificeren van de ontluikende eiwitsynthese is waardevol voor het verkrijgen van inzicht in de fysiologische rol van trajecten die relevant zijn voor de ontwikkeling en genezen van hepatocyte-gerelateerde ziekten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hoewel verschillende vereeuwigd hepatische cellijnen zijn voorgesteld en gebruikt voor het onderzoeken van de lever functies49,50,51,52, deze cellen in het algemeen ontbreekt aan de belangrijke en fundamentele functies van de normale hepatocyten, zoals de uitdrukking van albumine (Figuur 3). Het wordt algemeen erkend, daarom, dat met behulp van primaire hepatocyten…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Drs. Joonbae Seo en Vivian Hwa voor hun wetenschappelijke inbreng en discussie. Dit werk werd gesteund door de National Institute of Health (NIH) (R01DK107530). T.N. werd gesteund door de PRESTO uit het Japan Science and Technology Agency. Een deel van deze studie werd gesteund door een subsidie van NIH (P30DK078392) voor de spijsvertering ziekte Core onderzoekscentrum in Cincinnati.
Materials
| HEPES buffer | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-tetraacetic acid | AmericanBio | AB00505-00025 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240-062 | |
| HBSS (10X) no calcium, magnesium, phenol red | Gibco | 14185-052 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Density gradient buffer | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvate | Gibco | 11885-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) | Gibco | 1897141 | |
| Williams medium E, no glutamine | Gibco | 12551-032 | |
| L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement | Gibco | 35050-061 | |
| Collagenase Type X | Wako Pure Chemical Industries | 039-17864 | |
| Perfusion pump | Cole-Parmer | Masterflex L/S | Equipment |
| IV administration set | EXELINT | 29081 | Equipment |
| A water bath | REVSCI | RS-PB-200 | Equipment |
| Tube heater | Fisher Scientific | Isotemp | Equipment |
| Ethanol | Decon Lab, Inc | 0-39613 | |
| Isoflurane | PHOENIX | 10250 | |
| Autoclaved Cotton Tips | Fisherbrand | 23-400-124 | |
| 100 mm Petri Dish | TPP | 93100 | |
| Connector (Male Luer Lock Ring) | Cole-Parmer instrument | EW-4551807 | |
| 24G catheters | TERUMO | Surflo 24Gx3/4' | |
| 100 μm Filter (CELL STRAINERS) | VWR | 10199-658 | |
| 15 ml conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-666 | |
| 50 ml conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-658 | |
| Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNE | Invitrogen | C33370 | |
| AHA (L-azidohomoalanine) | Invitrogen | C10102 | |
| DMEM (methionine free) | Gibco | 21013024 | |
| L-Cystine Dihydrochloride | SIGMA | C2526 | |
| Laemmli sample buffer | BioRad | 161-0737 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | SIGMA | P9599 | |
| SDS solution (20%) | BioRad | 161-0418 | |
| Tris-HCL (1M) | American Bioanalytical | AB14044-01000 | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail | SIGMA | P5726 | |
| Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA) | BioRad | 500-0207 | |
| 6-well tissue culture plate | TPP | 92006 | |
| Digital Heatblock | VWR | 12621-092 | Equipment |
| Multi-Rotator | Grant-bio | PTR-60 | Equipment |
| Ultrasonic Sonicator | Cole-Parmer | GE130PB | Equipment |
| Standard Heavy-Duty Vortex Mixer | VWR | 97043-566 | Equipment |
| A variable mode laser scanner | GE Healthcare Life Science | FLA 9500 | Equipment |
| Coomassie-dye reagent | Thermo Scientific | 24594 | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX53 | Equipment |
| Western Blotting apparatus | BioRad | 1658004 | Equipment |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | Equipment |
| Automated cell counter | BioRad | TC20 | Equipment |
| FluorChem R system | proteinsimple | – | Equipment |
| p-Ampka (T172) antibody | Cell signaling | 2535 | |
| Total-AMPK antibody | Cell signaling | 5832 | |
| Albumin antibody | Cell signaling | 4929 | |
| beta actin antibody | Santa Cruz | sc-130656 | |
| Fine scissors and forceps |
Referências
- Forbes, R. M., Cooper, A. R., Mitchell, H. H. The composition of the adult human body as determined by chemical analysis. Journal of Biological Chemistry. 203, 359-366 (1953).
- Charlton, M. R. Protein metabolism and liver disease. Baillieres Clinical Endocrinology and Metabolism. 10, 617-635 (1996).
- De, F. P., Lucidi, P. Liver protein synthesis in physiology and in disease states. Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care. 5, 47-50 (2002).
- Stoll, B., Gerok, W., Lang, F., Haussinger, D. Liver cell volume and protein synthesis. Biochemical Journal. 287 (Pt 1), 217-222 (1992).
- Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. Biochemical Journal. 284 (Pt 1), 1-13 (1992).
- Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochemical Journal. 312 (Pt 1), 163-167 (1995).
- Morrison, C. D., Laeger, T. Protein-dependent regulation of feeding and metabolism. Trends in Endocrinology and Metabolism. 26, 256-262 (2015).
- Bernardi, M., Ricci, C. S., Zaccherini, G. Role of human albumin in the management of complications of liver cirrhosis. Journal of Clinical and Experimental Hepatology. 4, 302-311 (2014).
- Abbasi, A., et al. Liver function tests and risk prediction of incident type 2 diabetes: evaluation in two independent cohorts. PLoS. One. 7, e51496 (2012).
- Schmidt, M. I., et al. Markers of inflammation and prediction of diabetes mellitus in adults (Atherosclerosis Risk in Communities study): a cohort study. Lancet. 353, 1649-1652 (1999).
- Stranges, S., et al. Additional contribution of emerging risk factors to the prediction of the risk of type 2 diabetes: evidence from the Western New York Study. Obesity (Silver Spring). 16, 1370-1376 (2008).
- Jin, S. M., et al. Change in serum albumin concentration is inversely and independently associated with risk of incident metabolic syndrome. Metabolism. 65, 1629-1635 (2016).
- Sluis, B., Wijers, M., Herz, J. News on the molecular regulation and function of hepatic low-density lipoprotein receptor and LDLR-related protein 1. Current Opinion in Lipidology. 28, 241-247 (2017).
- Viollet, B., et al. Activation of AMP-activated protein kinase in the liver: a new strategy for the management of metabolic hepatic disorders. Journal of Physiology. 574, 41-53 (2006).
- Li, H., Lee, J., He, C., Zou, M. H., Xie, Z. Suppression of the mTORC1/STAT3/Notch1 pathway by activated AMPK prevents hepatic insulin resistance induced by excess amino acids. Amerian Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 306, E197-E209 (2014).
- Qian, S. B., et al. mTORC1 links protein quality and quantity control by sensing chaperone availability. The Journal of Biological Chemistry. 285, 27385-27395 (2010).
- Carling, D. The AMP-activated protein kinase cascade–a unifying system for energy control. Trends in Biochemical Sciences. 29, 18-24 (2004).
- Hardie, D. G., Scott, J. W., Pan, D. A., Hudson, E. R. Management of cellular energy by the AMP-activated protein kinase system. FEBS Letters. 546, 113-120 (2003).
- Li, H., et al. AMPK activation prevents excess nutrient-induced hepatic lipid accumulation by inhibiting mTORC1 signaling and endoplasmic reticulum stress response. Biochimica et Biophysica Acta. 1842, 1844-1854 (2014).
- Proud, C. G. Role of mTOR signalling in the control of translation initiation and elongation by nutrients. Current Topics in Microbiology and Immunology. 279, 215-244 (2004).
- Sarbassov, D. D., Ali, S. M., Sabatini, D. M. Growing roles for the mTOR pathway. Current Opinion in Cell Biology. 17, 596-603 (2005).
- Reiter, A. K., Bolster, D. R., Crozier, S. J., Kimball, S. R., Jefferson, L. S. Repression of protein synthesis and mTOR signaling in rat liver mediated by the AMPK activator aminoimidazole carboxamide ribonucleoside. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 288, E980-E988 (2005).
- Cheng, S. W., Fryer, L. G., Carling, D., Shepherd, P. R. Thr2446 is a novel mammalian target of rapamycin (mTOR) phosphorylation site regulated by nutrient status. Journal of Biological Chemistry. 279, 15719-15722 (2004).
- Howell, J. J., et al. Metformin Inhibits Hepatic mTORC1 Signaling via Dose-Dependent Mechanisms Involving AMPK and the TSC Complex. Cell Metabolism. 25, 463-471 (2017).
- Inoki, K., Zhu, T., Guan, K. L. TSC2 mediates cellular energy response to control cell growth and survival. Cell. 115, 577-590 (2003).
- Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line Hepg2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism Disposition. 31, 1035-1042 (2003).
- Li, A. P., et al. Present status of the application of cryopreserved hepatocytes in the evaluation of xenobiotics: consensus of an international expert panel. Chemico-Biology Interactaction. 121, 117-123 (1999).
- Hengstler, J. G., et al. Cryopreserved primary hepatocytes as a constantly available in vitro model for the evaluation of human and animal drug metabolism and enzyme induction. Drug Metabolism and Reviews. 32, 81-118 (2000).
- Olsavsky, K. M., et al. Gene expression profiling and differentiation assessment in primary human hepatocyte cultures, established hepatoma cell lines, and human liver tissues. Toxicology and Applied Pharmacology. 222, 42-56 (2007).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Li, Y., Cai, S., Zhang, L., Li, X. Simultaneous isolation and primary culture of rat hepatocytes, hepatic stellate cells, Kupffer’s cells and hepatic sinus endothelial cells. Nan. Fang Yi. Ke. Da. Xue. Xue. Bao. 34, 532-537 (2014).
- Edwards, M., Houseman, L., Phillips, I. R., Shephard, E. A. Isolation of mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 987, 283-293 (2013).
- Schreiber, G., Schreiber, M. The preparation of single cell suspensions from liver and their use for the study of protein synthesis. Subcellular Biochemistry. 2, 307-353 (1973).
- Klaunig, J. E., Goldblatt, P. J., Hinton, D. E., Lipsky, M. M., Trump, B. F. Mouse liver cell culture. II. Primary culture. In Vitro. 17, 926-934 (1981).
- Puviani, A. C., Ottolenghi, C., Tassinari, B., Pazzi, P., Morsiani, E. An update on high-yield hepatocyte isolation methods and on the potential clinical use of isolated liver cells. Comparative Biochemistry and Physiology A Molecular and Integrative Physiology. 121, 99-109 (1998).
- Park, K. H., Song, S. C. Morphology of spheroidal hepatocytes within injectable, biodegradable, and thermosensitive poly(organophosphazene) hydrogel as cell delivery vehicle. Journal of Biosciences and Bioengineering. 101, 238-242 (2006).
- Li, K., et al. Improved performance of primary rat hepatocytes on blended natural polymers. Journal of Biomedicine and Material Research Part A. 75, 268-274 (2005).
- Battle, T., Stacey, G. Cell culture models for hepatotoxicology. Cell Biology Toxicology. 17, 287-299 (2001).
- Kravchenko, L., Petrenko, A., Shanina, I., Fuller, B. A simple non-enzymatic method for the isolation of high yields of functional rat hepatocytes. Cell Biology International. 26, 1003-1006 (2002).
- Berry, M. N., Grivell, A. R., Grivell, M. B., Phillips, J. W. Isolated hepatocytes–past, present and future. Cell Biology and Toxicology. 13, 223-233 (1997).
- Jiang, Q. D., et al. Isolation and identification of bovine primary hepatocytes. Genetics and Molecular Research. 12, 5186-5194 (2013).
- Pertoft, H., Laurent, T. C., Laas, T., Kagedal, L. Density gradients prepared from colloidal silica particles coated by polyvinylpyrrolidone (Percoll). Analytical Biochemistry. 88, 271-282 (1978).
- Lipford, G. B., Feng, Q., Wright, G. L. A method for separating bound versus unbound label during radioiodination. Analytical Biochemistry. 187, 133-135 (1990).
- Mukai, T., et al. In-vivo evaluation of indium-111-diethylenetriaminepentaacetic acid-labelling for determining the sites and rates of protein catabolism in mice. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 51, 15-20 (1999).
- Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Importance of Radioactive Labelling to Elucidate Inositol Polyphosphate Signalling. Topics in Current Chemistry. 375, 14 (2017).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angewandte Chemie International Edition. 41, 2596-2599 (2002).
- Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors. Journal of Virology. 85, 7546-7554 (2011).
- Hou, W. L., et al. Inhibition of mitochondrial complex I improves glucose metabolism independently of AMPK activation. Journal of Cell Molecular Medicine. 22, 1316-1328 (2018).
- Davalos, A., et al. miR-33a/b contribute to the regulation of fatty acid metabolism and insulin signaling. Proceedings of the National Academy of Science. , 9232-9237 (2011).
- DiPersio, C. M., Jackson, D. A., Zaret, K. S. The extracellular matrix coordinately modulates liver transcription factors and hepatocyte morphology. Molecular and Cellular Biology. 11, 4405-4414 (1991).
- Xu, L., et al. Human hepatic stellate cell lines, LX-1 and LX-2: new tools for analysis of hepatic fibrosis. Gut. 54, 142-151 (2005).
- Yang, L., Li, P., Fu, S., Calay, E. S., Hotamisligil, G. S. Defective hepatic autophagy in obesity promotes ER stress and causes insulin resistance. Cell Metabolism. 11, 467-478 (2010).
- Heinz, S., et al. Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation. Science Reports. 7, 45465 (2017).
