非放射性 L azidohomoalanine ラベル法による新生タンパク質合成解析用プライマリ マウス肝細胞の分離
Summary
ここでは、健康で機能的なプライマリ マウス肝細胞の隔離のためのプロトコルを提案する.非放射性標識基板による肝新生タンパク質合成の検出については、肝臓でのエネルギー代謝の恒常性のコンテキストでのタンパク質合成の基になるメカニズムを理解するために提供されました。
Abstract
肝細胞は肝実質細胞で、全身のエネルギー代謝に不可欠なタンパク質の合成・分泌を含む複数の代謝機能に従事します。マウスの肝臓から分離した初代肝細胞は、機能性や肝臓で発生する変更を理解する貴重な生物学的ツールを構成します。ここ我々 二段コラゲナーゼ灌流法を実行することによって分離およびプライマリ マウス肝細胞の培養方法を説明し、蛋白代謝を調査するために利用します。成体マウスの肝臓は順番にエチレング リコール ビス四酢酸 (グリコールエーテルジアミン四酢酸)、コラゲナーゼ、密度勾配バッファーと肝細胞の分離に続いてにおいて灌流します。これらの分離肝細胞は培養皿で実行可能な肝細胞の寄附の特性の大半を維持します。これらの肝細胞は、非放射性試薬の新生タンパク質合成を含むタンパク質代謝の評価に使用できます。示す分離肝細胞が容易に制御 Tetramethylrhodamine (耽羅) 蛋白質と化学療法選択の ligation の反作用を利用してエネルギー代謝に関与する蛋白合成の高い質と量の安定性を構成します。検出法および西部のしみが付く分析。したがって、この方法はエネルギー恒常性に関与する肝初期蛋白合成を調査するためです。次のプロトコルは、材料と質の高いプライマリ マウス肝細胞の分離と新生タンパク質合成の検出方法について説明します。
Introduction
タンパク質は重要な栄養素と人体の乾燥重量の約 50% はいくつかの生物学的特性と機能1のあるタンパク質から成る。したがって、タンパク質合成はほとんどエネルギーがかかるイベントの一つ、タンパク質の代謝変化は高代謝性疾患2,3、4を含む病気の開発に関連付けられています。肝臓で蛋白質の生合成は、総エネルギー消費量5,6の約 20-30% を占めています。また、タンパク質の機能としてだけでなく、パッシブまたは建物のブロックもアクティブな信号を仲介する因子は、肝臓の細胞内や細胞外7全身の代謝を調節します。合成され、肝臓とプラズマ8の最も豊富な蛋白質によって分泌される血清アルブミンの減らされたレベルが 2 型糖尿病の開発9,10,のリスクを増加させる例えば、11、血清アルブミンの濃度が高く、メタボリック シンドローム12を開発することに対して保護一方。邪魔やリポタンパク質を来すと LRP1 を含む、コレステロール恒常性を調節する、分泌または膜区切のラット肝タンパク質の混乱がさらに、インスリン抵抗性、高脂血症、動脈硬化症の発展につながることができます。13したがって、蛋白質代謝障害肝臓とその関連付けられた代謝性合併症に関与している分子病態生理学的メカニズムの同定は、薬理学的小説を発見するため役に立つかもしれない。発症を遅らせるか、またはインスリン抵抗性、糖尿病、非アルコール性脂肪肝など代謝性疾患の治療へのアプローチします。
タンパク質の合成は、細胞のエネルギー状態に密接に結びついた (例えば、蛋白質合成の伸長段階 1 つのペプチド結合の形成が必要 4 リン酸ジエステル結合14) 感知の分子経路によって調節されていると間や細胞内栄養アベイラビリティ15,16。AMP 活性化プロテインキナーゼ (AMPK) は、17エネルギー恒常性を維持する細胞内のエネルギー センサーの 1 つです。AMPK がアクティブになったときに細胞のエネルギー レベルが低下 AMPK やその対象となる基板に異化経路を刺激し、タンパク質合成18,19を含む同化の過程を阻害する機能します。タンパク質合成の調節は、複数の翻訳因子とリボソームタンパク質20のリン酸化によって媒介されます。ノートの哺乳類ラパマイシン標的複雑な 1 (mTORC1)、タンパク質合成の主要なドライバーは、AMPK の21の主要なターゲットの 1 つです。MTORC1 経路の活性化は、刺激的なタンパク質翻訳とオートファジー20,21により細胞の成長と増殖を強化します。したがって、AMPK の活性化が22mTORC1 を介したタンパク質合成を抑制することが論理です。確かに、AMPK の活性化を打ち消すし、直接その不活性化23と24タンパク質生合成の抑制につながるスレオニン残基 2446 (Thr2446) で mTORC1 を廃止します。また、AMPK 直接抑制することがないリン酸化と結節性硬化症複合 2 (TSC2)25 mTORC1 シグナル伝達カスケードの上流の調節因子である活性化による mTORC1 機能。要するに、肝臓でこれらの経路の制御不全は、しばしば代謝性疾患の開発にリンクされて、従ってエネルギーの制御にこれらの細道の役割を調査するため効果的な実験ツールを確立する重要な必要性があると肝細胞の蛋白質新陳代謝。
分離肝細胞の機能特性と体内肝細胞より体外肝由来細胞ライン26,27,28との強い類似性があります。それが示されているプライマリひと肝細胞が肝生検の 77% の類似を共有する HepG2 細胞を分化肝がん細胞と肝機能を調べるための広くのコンテキストで 48% 未満を表示するのに対し遺伝子発現プロファイル、29をです。したがって、肝機能と生理学の調査に重要です不死化細胞ではなく、初代肝細胞の利用、分離肝細胞の培養に使用可能ないくつかのプロトコル30,31をラットから特に。ラット肝細胞は細胞の比較的高い収率で役に立つ、マウス肝細胞は遺伝的変調マウスで広く利用できるため多くの科学的な面で大きな可能性を持ってください。ただし、健康と豊富な肝細胞および分子に基づく評価のマウスからの分離にはいくつかの技術的な課題があります: まず、バッファー試薬と肝臓を灌流してカニューレ挿入は非常に扱いにくい小さくて細いマウス門脈または下大静脈; のため第二に、分離の過程で細胞の長い操作時間を引き起こす可能性が減少細胞の量と質。第三に、非酵素的機械的分離法は、厳しい損傷で起因し、実行可能な分離肝細胞32,33の低収量を生成できます。1980 年代、コラゲナーゼ灌流法は動物の34の肝臓から肝細胞を分離するため導入されました。この手法はコラゲナーゼ灌流肝35,36,の37、カルシウム キレート剤ソリューション38,39, 酵素消化肝臓の注入と肝実質35の機械的解離。最初のステップで [Ca2 +] キレート (エチレンジアミン四酢酸、EDTA) を含むカルシウム [Ca2 +] 空きバッファーをマウス肝臓は灌流します。2 番目の手順では、マウスの肝臓は細胞-細胞外マトリックスの相互作用を分解するコラゲナーゼを含むバッファーと灌流します。ステップ 1 で使用するバッファーとは異なり [Ca2 +] 2 番目のステップのバッファーでイオンの存在はその後消化肝臓はさらにゆっくりと機械的に分離する間鉗子を使用して、効果的なコラゲナーゼに必要な肝カプセルと柔組織。最後に、結合組織はフィルタ リングによって削除され、その後遠心分離両方非実質細胞から実行可能な肝細胞と肝細胞以外の生物密度勾配バッファー40,41 を使って、42。本研究ではタンパク質合成の分析のためのマウスの肝臓から肝細胞を分離する変更された 2 段階コラゲナーゼ灌流法を紹介します。
蛋白質のカイネティックス、広く発現レベル、離職率を定量化し、蛋白質43高感度放射能44の検出のための生物の分布を決定する使用されます。ただし、放射性同位元素の使用には、高精度制御研究の状況と手順45が必要です。非放射性方法は開発されているし、ますます人気を集めています。Tetramethylrhodamine (耽羅) タンパク質検出法と化学療法選択の ligation の反作用はそれらの 1 つ、アジドとアルキン グループ46、よう携帯電話のイベントを分析する利用できる間化学療法選択的反応に基づいています新生タンパク質の合成とサブクラス、アジド基で修飾糖タンパク質の検出します。新生タンパク質合成の L Azidohomoalanine (L AHA、アジ化修飾アミノ酸) 代謝蛋白質に組み込まれて、耽羅タンパク質検出法47を使用して検出します。プライマリ マウス肝細胞のこの試金を使用して、我々 はミトコンドリアから ATP の可用性に新生タンパク質合成速度がしっかりとリンクされている表示と AMPK 活性化 (図 1)。
要約すると、プライマリ マウス肝細胞の使用率はタンパク質とエネルギー代謝を調査することが重要と新生タンパク質合成の定量化は開発に関連する経路の生理学的役割についての洞察を得るため貴重であると肝疾患の治療。
Protocol
Representative Results
Discussion
これらの細胞が一般に重要かつ基本的な不足がいくつか不死化肝細胞を提案し、肝機能49,50,51,52を調査するために使用すると、アルブミン (図 3) の式など、通常の肝細胞の機能。広く認識されて、したがって、初代肝細胞を利用したが肝臓の生理学および培養とこれらの細?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
科学的な議論には、夫妻 Joonbae Seo とビビアン華をありがとうございます。この作品は、国立衛生研究所 (NIH) (R01DK107530) によって支えられました。濃度は, は、日本科学技術振興機構のさきがけによって支えられました。本研究の一部は、シンシナティの消化器病研究コアセンターの NIH (P30DK078392) からの助成金によって支えられました。
Materials
| HEPES buffer | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-tetraacetic acid | AmericanBio | AB00505-00025 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240-062 | |
| HBSS (10X) no calcium, magnesium, phenol red | Gibco | 14185-052 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Density gradient buffer | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvate | Gibco | 11885-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) | Gibco | 1897141 | |
| Williams medium E, no glutamine | Gibco | 12551-032 | |
| L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement | Gibco | 35050-061 | |
| Collagenase Type X | Wako Pure Chemical Industries | 039-17864 | |
| Perfusion pump | Cole-Parmer | Masterflex L/S | Equipment |
| IV administration set | EXELINT | 29081 | Equipment |
| A water bath | REVSCI | RS-PB-200 | Equipment |
| Tube heater | Fisher Scientific | Isotemp | Equipment |
| Ethanol | Decon Lab, Inc | 0-39613 | |
| Isoflurane | PHOENIX | 10250 | |
| Autoclaved Cotton Tips | Fisherbrand | 23-400-124 | |
| 100 mm Petri Dish | TPP | 93100 | |
| Connector (Male Luer Lock Ring) | Cole-Parmer instrument | EW-4551807 | |
| 24G catheters | TERUMO | Surflo 24Gx3/4' | |
| 100 μm Filter (CELL STRAINERS) | VWR | 10199-658 | |
| 15 ml conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-666 | |
| 50 ml conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-658 | |
| Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNE | Invitrogen | C33370 | |
| AHA (L-azidohomoalanine) | Invitrogen | C10102 | |
| DMEM (methionine free) | Gibco | 21013024 | |
| L-Cystine Dihydrochloride | SIGMA | C2526 | |
| Laemmli sample buffer | BioRad | 161-0737 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | SIGMA | P9599 | |
| SDS solution (20%) | BioRad | 161-0418 | |
| Tris-HCL (1M) | American Bioanalytical | AB14044-01000 | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail | SIGMA | P5726 | |
| Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA) | BioRad | 500-0207 | |
| 6-well tissue culture plate | TPP | 92006 | |
| Digital Heatblock | VWR | 12621-092 | Equipment |
| Multi-Rotator | Grant-bio | PTR-60 | Equipment |
| Ultrasonic Sonicator | Cole-Parmer | GE130PB | Equipment |
| Standard Heavy-Duty Vortex Mixer | VWR | 97043-566 | Equipment |
| A variable mode laser scanner | GE Healthcare Life Science | FLA 9500 | Equipment |
| Coomassie-dye reagent | Thermo Scientific | 24594 | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX53 | Equipment |
| Western Blotting apparatus | BioRad | 1658004 | Equipment |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | Equipment |
| Automated cell counter | BioRad | TC20 | Equipment |
| FluorChem R system | proteinsimple | – | Equipment |
| p-Ampka (T172) antibody | Cell signaling | 2535 | |
| Total-AMPK antibody | Cell signaling | 5832 | |
| Albumin antibody | Cell signaling | 4929 | |
| beta actin antibody | Santa Cruz | sc-130656 | |
| Fine scissors and forceps |
Referências
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