Isolamento dos hepatócitos primários de rato para análise de síntese de proteína nascente pelo método de rotulagem não-radioativo L-azidohomoalanine
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para a isolação dos hepatócitos saudável e funcional principal do rato. Instruções para a detecção de síntese hepática da proteína nascente por substrato de rotulagem não-radioativo foram fornecidas para ajudar a compreender os mecanismos subjacentes a síntese de proteínas no contexto da homeostase do metabolismo energético no fígado.
Abstract
Hepatócitos são células parenquimais do fígado e envolver várias funções metabólicas, incluindo a síntese e secreção de proteínas essenciais para a homeostase de energia sistêmica. Primários hepatócitos isolados do fígado murino constituem uma valiosa ferramenta biológica para compreender as propriedades funcionais ou alterações que ocorrem no fígado. Neste documento descrevemos um método para o isolamento e a cultura de hepatócitos primários de rato através da realização de uma técnica de perfusão de colagenase em duas fases e discutir a sua utilização para investigar o metabolismo proteico. O fígado de um rato adulto sequencialmente é perfundido com ácido etilenodiaminotetracético de glicol de etileno-bis (EGTA) e colagenase, seguido pelo isolamento dos hepatócitos com o buffer de gradiente de densidade. Estes hepatócitos isolados são viáveis em placas de cultura e mantêm a maioria das características dotadas de hepatócitos. Estes hepatócitos podem ser usados para avaliação do metabolismo de proteínas, incluindo a síntese de proteína nascente com reagentes não-radioativo. Mostramos que os hepatócitos isolados são facilmente controlados e compreendem uma maior estabilidade de volume e qualidade de síntese de proteínas ligada ao metabolismo energético, utilizando a reação de quimio-seletiva da ligadura com uma proteína de diversos (TAMRA) método de detecção e análises de mancha ocidentais. Portanto, esse método é valioso para investigar a síntese hepática da proteína nascente ligado a homeostase de energia. O protocolo seguinte descreve os materiais e métodos para o isolamento dos hepatócitos de rato primária de alta qualidade e detecção de síntese de proteína nascente.
Introduction
A proteína é um importante elemento nutricional e aproximadamente 50% do peso seco de um corpo humano é composto de proteínas que tenham vários traços biológicos e funções1. Por conseguinte, síntese de proteínas é um dos eventos que consome mais energia e uma alteração no metabolismo de proteína é altamente associada com o desenvolvimento de doenças, incluindo doenças metabólicas2,3,4. No fígado, biossíntese de proteínas é responsável por aproximadamente 20 a 30% do consumo de energia total5,6. Além disso, a função de proteínas como não só passivo ou blocos de fígado, mas também ativas fatores de mediação de sinal intracelular ou extracelularmente para regular o metabolismo sistêmico7. Por exemplo, redução dos níveis de albumina de soro, o qual é sintetizado e secretado pelo fígado e a proteína mais abundante no plasma8, aumenta o risco de tipo 2 diabetes desenvolvimento9,10, 11, Considerando que uma maior concentração de albumina é protetor contra o desenvolvimento de síndrome metabólica12. Além disso, perturbado ou interrupção de proteínas hepáticas secretoras ou membrana-limite, que modulam a homeostase do colesterol, incluindo as lipoproteínas, LDLR e LRP1, pode levar ao desenvolvimento de resistência à insulina, dislipidemia ou aterosclerose 13. portanto, a identificação de mecanismos fisiopatológicos moleculares que estão envolvidos no distúrbio de metabolismo de proteínas no fígado e suas complicações metabólicas associadas pode ser útil para descobrir o romance farmacológica abordagens para retardar o aparecimento ou tratar doenças metabólicas como resistência à insulina, diabetes e esteatose hepática não-alcoólica.
Síntese de proteínas é fortemente ligado ao estado de energia celular (por exemplo, a formação de uma ligação peptídica durante a etapa de elongação da síntese de proteínas requer 4 de ligações fosfodiéster14) e é regulada pelas vias moleculares que detetam Intere intra – cellular disponibilidade nutriente15,16. Quinase de proteína AMP-ativada (AMPK) é um dos sensores de energia intracelular que mantêm a homeostase de energia17. Uma vez que a AMPK é ativada quando os níveis de energia celulares tornam-se mais baixos, AMPK e seus substratos direcionados a função de estimular vias catabólicos e inibem processos anabólicos, incluindo a síntese de proteína18,19. A regulação da síntese de proteínas é mediada por fosforilação de múltiplos fatores de tradução e proteínas ribossomais20. De nota, mamíferos alvo de rapamicina complexo 1 (mTORC1), um grande motorista da síntese de proteínas, é um dos principais alvos da AMPK21. Ativação da via mTORC1 aumenta o crescimento celular e a proliferação de estimulante proteína Tradução e autofagia20,21. Portanto, é lógico que a ativação da AMPK pode inibir a síntese de proteínas mediada por mTORC122. Com efeito, a ativação da AMPK neutraliza e fosforila diretamente mTORC1 no resíduo de treonina 2446 (Thr2446) levando a sua inactivação23 e supressão da biossíntese de proteínas24. Além disso, AMPK indiretamente pode inibir a função de mTORC1 por fosforilação e ativação de esclerose tuberosa complexa 2 (TSC2)25 que é o regulador upstream da cascata de sinalização de mTORC1. Em suma, dysregulation dessas vias no fígado é muitas vezes ligada ao desenvolvimento de doenças metabólicas e, portanto, há uma necessidade crítica para estabelecer ferramentas experimentais eficazes para investigar o papel destas vias na regulação da energia e metabolismo proteico nos hepatócitos.
Há uma forte semelhança entre as propriedades funcionais dos hepatócitos primários isolados e hepatócitos na vivo do que em vitro derivados de fígado célula linhas26,27,.28. Tem sido demonstrado que hepatócitos humanos primários compartilham 77% de similaridade com o de biópsias hepáticas, enquanto as células HepG2, que são as células cancerosas hepáticas bem diferenciadas e amplamente utilizado para investigar as funções hepáticas, exibem menos de 48% no contexto da 29de perfis de expressão gênica. Portanto, utilização dos hepatócitos primários, ao invés de células de cultura imortalizado, é de vital importância na investigação de Fisiologia e função hepática, e vários protocolos estão disponíveis para o isolamento e a cultura de hepatócitos primários especialmente de ratos30,31. Enquanto os hepatócitos de rato são úteis com um rendimento relativamente maior de células, hepatócitos de rato teriam um potencial maior em muitos aspectos científicos devido à ampla disponibilidade de camundongos geneticamente modulados. No entanto, existem vários desafios técnicos em isolar saudáveis e abundantes hepatócitos primários de rato para celular e molecular-avaliações baseadas em: primeiro, inserção de cânula para perfundir o fígado com reagentes de buffer é muito difícil de lidar por causa da veia porta de rato pequeno e fino ou veia cava inferior; em segundo lugar, um tempo de manipulação das células durante o isolamento pode causar redução na quantidade de células e de qualidade; métodos de separação mecânica não enzimáticos, terceiro podem resultar em danos graves e produzir um baixo rendimento dos hepatócitos primários isolados viável32,33. Na década de 1980, a técnica de perfusão de colagenase foi introduzida para isolar os hepatócitos a partir de fígados de animais34. Este método baseia-se na perfusão de colagenase da hepática35,36,37, infusão de fígado com cálcio quelante solução38,39, digestão enzimática e dissociação mecânica do parênquima hepático35. Na primeira etapa, um fígado de rato é perfundido com uma reserva de cálcio [Ca2 +] livre contendo um quelante [Ca2 +] (etilenodiamina ácido etilenodiaminotetracético, EDTA). Na segunda etapa, o fígado de rato é perfundido com um buffer contendo colagenase para hidrolisar as interações da matriz extracelular-celular. Ao contrário o buffer usado no primeiro passo, a presença de íons [Ca2 +] no buffer da segunda etapa é necessária para a atividade de colagenase eficaz, após o qual o fígado digerido tem que ser ainda mais suavemente e mecanicamente separadas usando pinça entre o cápsula hepática e tecido parenquimático. Finalmente, tecido conjuntivo é removido por filtração, e posterior centrifugação separa hepatócitos viáveis de células não-parenquimatosas tanto e não-vivos hepatócito com o uso de densidade gradiente reserva40,41 ,42. No presente estudo, mostramos uma técnica de perfusão de colagenase modificados em duas etapas para isolar os hepatócitos primários de um fígado de rato para a análise da síntese de proteínas.
O radioativos das proteínas é amplamente utilizado para quantificar os níveis de expressão, taxas de rotatividade e determinar a distribuição biológica de proteínas43 devido à alta sensibilidade de detecção de radioatividade44. No entanto, o uso de isótopos radioativos requer pesquisa altamente controlada circunstâncias e procedimentos45. Métodos alternativos não-radioativo foram desenvolvidos e cada vez mais ganharam na popularidade. Reação da ligadura quimio-seletivo com um método de deteção de proteínas de diversos (TAMRA) é um deles e é baseada na reação de quimio-seletiva entre uma azida e alquino grupos46, que pode ser utilizado para analisar eventos celulares tais como detectando a síntese da proteína nascente e subclasses de glicoproteínas modificadas com um grupo de azida sódica. Para a síntese de proteína nascente, L-Azidohomoalanine (L-AHA, um aminoácido azida modificado) pode ser metabolicamente incorporado em proteínas e detectado usando o de método de deteção de proteínas TAMRA47. Usando este ensaio em hepatócitos primários de rato, mostramos que a taxa de síntese de proteína nascente está fortemente ligada à disponibilidade de ATP de mitocondrial e ativação da AMPK (Figura 1).
Em resumo, utilização dos hepatócitos primários de rato é crucial para o metabolismo de proteínas e energia a investigar e quantificar a síntese da proteína nascente é valioso para obter insights sobre o papel fisiológico de caminhos relevantes para o desenvolvimento e cura de doenças relacionadas ao hepatócito.
Protocol
Representative Results
Discussion
Embora várias linhas de células hepáticas imortalizado foram propostas e usadas para investigar as funções do fígado49,50,,51,52, essas células geralmente faltam o importante e fundamental funções dos hepatócitos normais, tais como a expressão de albumina (Figura 3). É amplamente reconhecido, portanto, que utilizando hepatócitos primários é uma valio…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos os Drs Joonbae Seo e Vivian Hwa sua entrada científica e discussão. Este trabalho foi financiado pelo National Institute of Health (NIH) (R01DK107530). T.N. foi apoiada pelo PRESTO da Japão de ciência e tecnologia da agência. Uma parte deste estudo foi suportada por uma concessão do NIH (P30DK078392) para o centro de núcleo de pesquisa de doença digestivo em Cincinnati.
Materials
| HEPES buffer | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-tetraacetic acid | AmericanBio | AB00505-00025 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240-062 | |
| HBSS (10X) no calcium, magnesium, phenol red | Gibco | 14185-052 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Density gradient buffer | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvate | Gibco | 11885-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) | Gibco | 1897141 | |
| Williams medium E, no glutamine | Gibco | 12551-032 | |
| L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement | Gibco | 35050-061 | |
| Collagenase Type X | Wako Pure Chemical Industries | 039-17864 | |
| Perfusion pump | Cole-Parmer | Masterflex L/S | Equipment |
| IV administration set | EXELINT | 29081 | Equipment |
| A water bath | REVSCI | RS-PB-200 | Equipment |
| Tube heater | Fisher Scientific | Isotemp | Equipment |
| Ethanol | Decon Lab, Inc | 0-39613 | |
| Isoflurane | PHOENIX | 10250 | |
| Autoclaved Cotton Tips | Fisherbrand | 23-400-124 | |
| 100 mm Petri Dish | TPP | 93100 | |
| Connector (Male Luer Lock Ring) | Cole-Parmer instrument | EW-4551807 | |
| 24G catheters | TERUMO | Surflo 24Gx3/4' | |
| 100 μm Filter (CELL STRAINERS) | VWR | 10199-658 | |
| 15 ml conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-666 | |
| 50 ml conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-658 | |
| Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNE | Invitrogen | C33370 | |
| AHA (L-azidohomoalanine) | Invitrogen | C10102 | |
| DMEM (methionine free) | Gibco | 21013024 | |
| L-Cystine Dihydrochloride | SIGMA | C2526 | |
| Laemmli sample buffer | BioRad | 161-0737 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | SIGMA | P9599 | |
| SDS solution (20%) | BioRad | 161-0418 | |
| Tris-HCL (1M) | American Bioanalytical | AB14044-01000 | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail | SIGMA | P5726 | |
| Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA) | BioRad | 500-0207 | |
| 6-well tissue culture plate | TPP | 92006 | |
| Digital Heatblock | VWR | 12621-092 | Equipment |
| Multi-Rotator | Grant-bio | PTR-60 | Equipment |
| Ultrasonic Sonicator | Cole-Parmer | GE130PB | Equipment |
| Standard Heavy-Duty Vortex Mixer | VWR | 97043-566 | Equipment |
| A variable mode laser scanner | GE Healthcare Life Science | FLA 9500 | Equipment |
| Coomassie-dye reagent | Thermo Scientific | 24594 | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX53 | Equipment |
| Western Blotting apparatus | BioRad | 1658004 | Equipment |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | Equipment |
| Automated cell counter | BioRad | TC20 | Equipment |
| FluorChem R system | proteinsimple | – | Equipment |
| p-Ampka (T172) antibody | Cell signaling | 2535 | |
| Total-AMPK antibody | Cell signaling | 5832 | |
| Albumin antibody | Cell signaling | 4929 | |
| beta actin antibody | Santa Cruz | sc-130656 | |
| Fine scissors and forceps |
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