Aislamiento de hepatocitos primario de ratón para proteína naciente síntesis análisis por el método de etiquetado no radiactivo L-azidohomoalanine
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento de hepatocitos primario de ratón sano y funcional. Para detectar la síntesis hepática de la proteína naciente por substrato etiquetado no radiactivo se instrucciones para ayudar a comprender los mecanismos subyacentes a la síntesis de proteínas en el marco de la homeostasis del metabolismo energético en el hígado.
Abstract
Hepatocitos son células parenquimatosas del hígado y realizar múltiples funciones metabólicas, incluyendo la síntesis y secreción de proteínas esenciales para la homeostasis de energía sistémica. Hepatocitos primarios aislados del hígado murino constituyen una valiosa herramienta biológica para comprender las propiedades funcionales o alteraciones que se producen en el hígado. Aquí describimos un método para el aislamiento y cultivo de hepatocitos primario de ratón mediante la realización de una técnica de perfusión de colagenasa de dos etapas y discutir su utilización para la investigación de metabolismo de la proteína. El hígado de un ratón adulto secuencialmente es inundado con ácido tetraacético de glicol de etileno bis (EGTA) y colagenasa, seguido por el aislamiento de hepatocitos con el tampón de gradiente de densidad. Estos hepatocitos aislados son viables en las placas de cultivo y mantienen la mayoría de características dotadas de hepatocitos. Estos hepatocitos pueden utilizarse para la evaluación del metabolismo de proteína incluyendo la síntesis de la proteína naciente con reactivos no radiactivo. Demostramos que los hepatocitos aislados son controlados fácilmente y forman una mayor estabilidad de la calidad y el volumen de la síntesis de proteínas vinculada al metabolismo energético mediante la utilización de la reacción de ligadura quimioterapia selectiva a una proteína Tetramethylrhodamine (TAMRA) método de detección y análisis Blot western. Por lo tanto, este método es valioso para la investigación de síntesis de la proteína naciente hepática relacionada con la homeostasis de la energía. El siguiente protocolo describe los materiales y métodos para la detección de la síntesis de la proteína naciente y el aislamiento de hepatocitos primario de alta calidad de ratón.
Introduction
La proteína es un elemento nutricional importante y aproximadamente el 50% del peso seco de un cuerpo humano está compuesto de proteínas que tienen varios rasgos biológicos y funciones1. En consecuencia, la síntesis de proteínas es uno de los eventos que la mayoría de energía y una alteración en el metabolismo de la proteína es altamente asociada con el desarrollo de enfermedades, incluyendo enfermedades metabólicas2,3,4. En el hígado, biosíntesis de la proteína representa aproximadamente 20 – 30% del total de energía consumo5,6. Además, la función de las proteínas no sólo pasiva o bloques del hígado, pero también activas factores de mediación de señal intracelular o extracelularmente para regular el metabolismo sistémico7. Por ejemplo, niveles reducidos de albúmina sérica, que es sintetizada y secretada por el hígado y la proteína más abundante en el plasma8, aumenta el riesgo de diabetes tipo 2 desarrollo9,10, 11, mientras que una mayor concentración de albúmina sérica es protectora contra el desarrollo de síndrome metabólico12. Además, disturbado o ruptura de las proteínas hepáticas secretores o membrana-limite, que modulan las homeostasis del colesterol, incluyendo lipoproteínas, LDLR y LRP1, puede conducir al desarrollo de resistencia a la insulina, hiperlipidemia y ateroesclerosis 13. por lo tanto, la identificación de los mecanismos fisiopatológicos moleculares que están involucrados en la alteración del metabolismo de proteínas en el hígado y sus complicaciones metabólicas asociadas podría ser útil para descubrir la novela farmacológica enfoques para retardar Inicio o tratar enfermedades metabólicas como la resistencia a la insulina, diabetes y hígado graso no alcohólico.
Síntesis de la proteína está estrechamente ligada a la situación de la energía celular (p. ej., la formación de un enlace peptídico durante la etapa de elongación de la síntesis proteica requiere de enlaces fosfodiéster 414) y está regulada por vías moleculares que sensación Inter y intra cellular la disponibilidad de nutrientes15,16. Quinasa activada por AMP (AMPK) es uno de los sensores de energía intracelular que mantienen la homeostasis de energía17. Una vez que la AMPK se activa cuando los niveles de energía celulares se baja, AMPK y sus sustratos específicos función para estimular vías catabólicas e inhiben los procesos anabólicos incluyendo proteína síntesis18,19. La regulación de la síntesis de proteínas está mediada por fosforilación de múltiples factores de traducción y proteínas ribosomales20. De la nota, el blanco mamífero de rapamicina complejo 1 (mTORC1), un motor importante de la síntesis de proteínas, es uno de los principales objetivos de AMPK21. Activación de la vía de la mTORC1 aumenta el crecimiento celular y la proliferación de proteína estimulante traducción y autofagia20,21. Por lo tanto, es lógico que activación de la AMPK puede inhibir la síntesis de proteína mTORC1 mediada por22. De hecho, la activación de la AMPK contrarresta y fosforila directamente mTORC1 en residuos de treonina 2446 (Thr2446) conduce a su inactivación23 y la supresión de la biosíntesis de proteína24. Por otra parte, AMPK indirectamente puede inhibir la función de mTORC1 por fosforilación y activación de esclerosis tuberosa el complejo 2 (TSC2)25 que es el regulador de aguas arriba de la cascada de señalización de mTORC1. En definitiva, desregulación de estas vías en el hígado a menudo está relacionada con el desarrollo de enfermedades metabólicas y por lo tanto hay una necesidad crítica para establecer eficaces herramientas experimentales para investigar el papel de estas vías en la regulación de energía y metabolismo de proteínas en los hepatocitos.
Existe una fuerte similitud entre las propiedades funcionales de hepatocitos primarios aislados y en vivo hepatocitos que con en vitro derivados del hígado de la célula líneas26,27,28. Se ha demostrado que hepatocitos humanos primarios comparten similitud de 77% con la de las biopsias del hígado, mientras que las células HepG2, que son las células cancerígenas hepáticas bien diferenciadas y ampliamente utilizan para investigar las funciones hepáticas, muestran menos del 48% en el contexto de 29los perfiles de expresión génica. Por lo tanto, la utilización de hepatocitos primarios, en lugar de células inmortalizadas de la cultura, es de vital importancia en la investigación de la fisiología y función hepática, y varios protocolos están disponibles para el aislamiento y cultivo de hepatocitos primarios especialmente de las ratas30,31. Mientras que los hepatocitos de rata son útiles con un rendimiento relativamente superior de las células, hepatocitos de ratón tienen un potencial mayor en muchos aspectos científicos debido a la amplia disponibilidad de ratones genéticamente modulados. Sin embargo, hay varias dificultades técnicas en el aislamiento de hepatocitos primarias sanas y abundantes de los ratones para las evaluaciones en base celular y molecular: en primer lugar, inserción de cánula para inundar el hígado con reactivos buffer es muy difícil de manejar debido al ratón pequeño y delgado de la vena porta o vena cava inferior; en segundo lugar, un tiempo de manipulación de las células durante el aislamiento puede causar reducción en la cantidad de células y la calidad; métodos de separación mecánica en tercer lugar, no-enzimáticos pueden provocar daños graves y producir un bajo rendimiento de hepatocitos primarios aislados viable32,33. En la década de 1980, técnica de perfusión de colagenasa se introdujo para aislar hepatocitos de hígados de animales34. Este método se basa en perfusión de colagenasa de los hígado35,36,37, infusión de hígado con calcio quelante solución38,39, digestión enzimática y disociación mecánica de la parenquimia hepática35. En el primer paso, un hígado de ratón es inundado con un tampón libre de calcio [Ca2 +] que contiene un quelante de [Ca2 +] (ácido etilendiamina tetraacético EDTA). En el segundo paso, el hígado de ratón es inundado con un tampón que contienen colagenasa para hidrolizar las interacciones de la matriz extracelular a celular. A diferencia del búfer utilizado en el paso uno, la presencia de iones [Ca2 +] en el búfer de la segunda etapa se requiere para la actividad de la colagenasa eficaz, después de que el hígado digerido tiene que ser más suavemente y mecánicamente separados usando fórceps entre el la cápsula hepática y tejido parenquimatoso. Finalmente, del tejido conectivo se elimina por filtración y posterior centrifugación separa hepatocitos viables de tanto células no parenquimatosas y hepatocito no vivo con el uso de densidad gradiente buffer40,41 ,42. En el presente estudio, nos muestran una técnica de perfusión de colagenasa modificado dos pasos para aislar hepatocitos primarios de un hígado de ratón para el análisis de la síntesis de proteínas.
El radiolabeling de proteínas es ampliamente utilizado para cuantificar los niveles de expresión, tasas de rotación y determinar la distribución biológica de las proteínas43 debido a la alta sensibilidad de detección de radiactividad44. Sin embargo, el uso de isótopos radiactivos requiere de circunstancias y procedimientos de investigación altamente controlada45. Métodos no radiactivos alternativos se han desarrollado y han adquirido cada vez más en popularidad. La reacción de la ligadura selectiva de quimio con un método de detección de la proteína Tetramethylrhodamine (TAMRA) es uno de ellos y se basa en la reacción quimio selectiva entre una azida y alquino grupos46, que pueden ser utilizadas para analizar eventos celulares tales como detección de síntesis de la proteína naciente y subclases de glicoproteínas modificadas con un grupo de azida. Para la síntesis de la proteína naciente, L-Azidohomoalanine (L-AHA, un aminoácido modificado de la azida) puede incorporar proteínas metabólicamente y detectado mediante el uso de método de detección de la proteína TAMRA47. Usando este ensayo en hepatocitos primarios de ratón, muestran que la tasa de síntesis de la proteína naciente está estrechamente ligada a la disponibilidad de ATP de mitocondrial y la activación de AMPK (figura 1).
En Resumen, utilización de hepatocitos primario de ratón es fundamental para investigar el metabolismo proteico y energético y cuantificación de la síntesis de la proteína naciente es valiosa para obtener información sobre el papel fisiológico de las vías pertinentes para el desarrollo y curación de enfermedades relacionadas con el hepatocito.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aunque varias líneas inmortalizadas de la célula hepática han sido propuestas y usados para investigar funciones hepáticas49,50,51,52, estas células carecen generalmente de la importante y fundamental funciones de los hepatocitos normales, como la expresión de albúmina (figura 3). Es ampliamente reconocido, por lo tanto, que utilizando hepatocitos primarios …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los Drs. Joonbae Seo y Vivian Hwa por sus contribuciones científicas y discusión. Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de salud (NIH) (R01DK107530). T.N. fue apoyado por el PRESTO de la Agencia de tecnología y ciencia de Japón. Una parte de este estudio fue apoyada por una subvención del NIH (P30DK078392) para el centro digestivo enfermedad investigación Core en Cincinnati.
Materials
| HEPES buffer | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-tetraacetic acid | AmericanBio | AB00505-00025 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240-062 | |
| HBSS (10X) no calcium, magnesium, phenol red | Gibco | 14185-052 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Density gradient buffer | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvate | Gibco | 11885-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) | Gibco | 1897141 | |
| Williams medium E, no glutamine | Gibco | 12551-032 | |
| L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement | Gibco | 35050-061 | |
| Collagenase Type X | Wako Pure Chemical Industries | 039-17864 | |
| Perfusion pump | Cole-Parmer | Masterflex L/S | Equipment |
| IV administration set | EXELINT | 29081 | Equipment |
| A water bath | REVSCI | RS-PB-200 | Equipment |
| Tube heater | Fisher Scientific | Isotemp | Equipment |
| Ethanol | Decon Lab, Inc | 0-39613 | |
| Isoflurane | PHOENIX | 10250 | |
| Autoclaved Cotton Tips | Fisherbrand | 23-400-124 | |
| 100 mm Petri Dish | TPP | 93100 | |
| Connector (Male Luer Lock Ring) | Cole-Parmer instrument | EW-4551807 | |
| 24G catheters | TERUMO | Surflo 24Gx3/4' | |
| 100 μm Filter (CELL STRAINERS) | VWR | 10199-658 | |
| 15 ml conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-666 | |
| 50 ml conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-658 | |
| Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNE | Invitrogen | C33370 | |
| AHA (L-azidohomoalanine) | Invitrogen | C10102 | |
| DMEM (methionine free) | Gibco | 21013024 | |
| L-Cystine Dihydrochloride | SIGMA | C2526 | |
| Laemmli sample buffer | BioRad | 161-0737 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | SIGMA | P9599 | |
| SDS solution (20%) | BioRad | 161-0418 | |
| Tris-HCL (1M) | American Bioanalytical | AB14044-01000 | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail | SIGMA | P5726 | |
| Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA) | BioRad | 500-0207 | |
| 6-well tissue culture plate | TPP | 92006 | |
| Digital Heatblock | VWR | 12621-092 | Equipment |
| Multi-Rotator | Grant-bio | PTR-60 | Equipment |
| Ultrasonic Sonicator | Cole-Parmer | GE130PB | Equipment |
| Standard Heavy-Duty Vortex Mixer | VWR | 97043-566 | Equipment |
| A variable mode laser scanner | GE Healthcare Life Science | FLA 9500 | Equipment |
| Coomassie-dye reagent | Thermo Scientific | 24594 | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX53 | Equipment |
| Western Blotting apparatus | BioRad | 1658004 | Equipment |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | Equipment |
| Automated cell counter | BioRad | TC20 | Equipment |
| FluorChem R system | proteinsimple | – | Equipment |
| p-Ampka (T172) antibody | Cell signaling | 2535 | |
| Total-AMPK antibody | Cell signaling | 5832 | |
| Albumin antibody | Cell signaling | 4929 | |
| beta actin antibody | Santa Cruz | sc-130656 | |
| Fine scissors and forceps |
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