マウスへのレーザ レンチ ウイルス遺伝子導入受精卵
Summary
マウスの受精卵および初期胚は透明帯、遺伝子導入に対する障壁を形成する糖タンパク質マトリックスによって保護されています。この資料では、ヘッジホッグ レンチウイルスベクターを持つ胚細胞、トランスジェニック マウスを作成するレーザーと帯を穿孔するためのプロトコルについて説明します。
Abstract
異哺乳動物細胞への遺伝子導入のための効率的なベクトルであります。次の伝達、レンチ ウイルスのゲノムは、安定ホスト染色体に組み込まれており、子孫に渡されます。したがって、彼らは安定したセルラインの作成、指標、生体内で配信、トランスジェニック動物を作成する単一細胞の受精卵の伝達の理想的なベクトルであります。しかし、マウス受精卵、早い段階の胚は透明帯、レンチ ウイルス遺伝子導入に対する障壁を形成する糖タンパク質マトリックスによって保護されています。レンチが大きすぎて帯を貫通する、通常囲卵腔、帯と胚の細胞間のスペースにウイルス粒子によって配信されます。熟練技術者や専門機器の要件がマウス胚への遺伝子導入のためのレンチの使用を最小限に抑えます。この資料では、レーザーで帯を穿孔によって構造のマウス受精卵のためのプロトコルについて説明します。レーザー穿孔胚に損害発生しませんができ異遺伝子デリバリーの萌芽期細胞へのアクセスを得るために。導入された胚は、胚盤胞、体外に開発し、偽妊娠マウスに注入した場合、トランスジェニック子犬に発展できます。このプロトコルで使用されるレーザーは、効果的で使いやすいです。安定のレンチによって配信される遺伝子マウス胚性細胞に組み込む、生殖著作。これはトランスジェニック マウスの作成を必要としないマイクロマニピュレーション、受精卵のための代替方法です。
Introduction
このメソッドは、レンチによる胚性細胞を遺伝子送達用アクセスできるように構造のマウス受精卵の透明帯の詳細な手順を提供します。レンチは、自然哺乳類細胞への効率的な遺伝子導入のために設計されています。彼らは分割と非分裂細胞に感染してそのホスト染色体1にレンチ ウイルスのゲノムを統合します。レンチ ウイルスの宿主細胞の範囲は、容易に VSV G 蛋白質2の広範な親和性により水疱性口内炎ウイルス (VSV G)、糖タンパク質と遺伝子組換えレンチ ウイルス、pseudotyping によって拡大します。次の伝達、レンチ ウイルス遺伝子は統合、トランスジェニック動物を生成するための理想的なツールを作成する彼らのホストの染色体の一部として安定。初期段階の胚細胞に配信、レンチ ウイルスのゲノムを複製および全体の有機体で表されます。レンチ ウイルス伝達はマウス、ラット、鶏、ウズラの生産につながっているし、豚の3,4,5,6,7遺伝子組み換えの他の種の間で。レンチ ウイルスの遺伝子配達の典型的な方法では、熟練した技術者や専門機器の初期段階の胚をカプセル化オスミウム障壁を克服するただし、必要があります。このメソッドの全体的な目標は、permeabilize ゾナ レンチ ウイルス遺伝子導入を容易にするためにレーザーを使用する方法について説明することです。
哺乳類の卵は、受精環境相互作用8,9を制限して多精子侵入に対する受精卵を保護するために、次を固める透明帯によって囲まれています。帯は、胚が胚盤胞と孵化まで胚細胞からレンチを保つバリアを形成します。培養マウスは 4 日後、卵のハッチを受精卵し、孵化仔に正常な開発のための前に偽妊娠マウスに注入する必要があります。したがって、伝達、レンチは、囲卵腔、帯と胚の細胞間のスペースに、ソナから孵化する前に microinjected が。
透明帯はしばしば受精率10を増加する人間の卵子の体外受精のため削除されます。ただし、マウス透明帯の化学取り外しは悪影響マウス胚発生に影響を与えるし、胚細胞11,12に有害であります。マウスの受精卵への遺伝子導入のための他の方法は、細胞核13に DNA の直接によって透明帯障壁を克服します。前核顕微注入は胚に遺伝子を提供する効率的な手段です。ただし、それぞれの胚は、マイクロインジェクションに対して個別に行われている、実践可能性があります骨の折れると初心者ユーザーのため時間がかかる。
エレクトロポレーションや photoporation などの他の方法は過渡の有用であり、短期の遺伝子導入マウス受精卵14,,1516。これらのメソッドは、CRISPR Cas9 コンポーネントとリコンビナーゼを配信に使用される広範囲。しかし、遺伝子組み換えを作成する遺伝子のエレクトロポレーションと photoporation の配信を効率的に使用できません。パンクチャド マウス精巣上体から収集される精子はまた異によって導入、トランスジェニック動物17,18,19、を生成する体外受精用20。
このプロトコルではマウス胚にレンチ ウイルス遺伝子導入はイオン レーザーを用いたゾナによって促進されます。XYClone レーザーは体外受精21と22胚性幹細胞の培養のための援助として開発されました。簡単なセットアップと使いやすい小型の装置です。顕微鏡にインストールされて、それは対物レンズの領域を占有し、付属のソフトにより、顕微鏡の接眼レンズをのぞきながらレーザーを目指して (プロトコルを見なさい: セクション 3)。帯は XYClone レーザによる穴あき、異できます遺伝子配信23の文化メディアに導入します。複数のレンチは、染色体の混入のための複数の遺伝子を同時に提供するされる可能性があります。
このプロトコルを特定する方法を説明し、文化マウス受精卵、透明帯の穿孔のためのレーザーの使用を示しています、レンチによるマウス胚性細胞の情報伝達を示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
彼らのホストのゲノムに統合する、異能力は彼らに安定的に遺伝子配達のための理想的なベクトルをなります。レンチウイルスベクターは、セル固有または誘導性プロモーターや選択マーカー蛍光部分に対応することができます遺伝物質の最大 8.5 プラスミド ペア (kbp) を運ぶことができます。ゲノム剤、宿主ゲノムの一部としてレプリケートすることができます、表現目的の時点でアクティ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立研究所の健康 (NIH)、国立環境衛生研究所 (NIEHS) の学内研究プログラムによって支えられました。原稿および有用な助言の批判的な読みの博士ロバート Petrovich と博士ジェイソン ・ ウィリアムスに感謝しております。認め、博士ベルント光沢、ノックアウト コア、フローサイトメトリーの流れ設備、蛍光顕微鏡とイメージング センター、彼らの技術的な貢献のため、NIEHS の比較医学支店設備を感謝も申し上げます。比較医学支店から氏デビッド グールディングと写真やイラストをご提供する NIEHS イメージング センターさんロイス Wyrick に感謝したいと思います。
Materials
| CD510B-1 plasmid | System Biosciences | CD510B-1 | used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma | DMPS5X | culturing embryos |
| hyaluronidase | Sigma | H3506 | used to remove cumulus cells |
| XYClone Laser | Hamilton Thorne Biosciences | perforating mouse fertilized eggs | |
| Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device | ParaTechs | 60010 | NSET of embryos |
| KSOM medium | Millipore | MR-020P-5F | culturing embryos |
| Composition of KSOM: | mg/100mL | ||
| NaCl | 555 | ||
| KCl | 18.5 | ||
| KH2PO4 | 4.75 | ||
| MgSO4 7H2O | 4.95 | ||
| CaCl2 2H2O | 25 | ||
| NaHCO3 | 210 | ||
| Glucose | 3.6 | ||
| Na-Pyruvate | 2.2 | ||
| DL-Lactic Acid, sodium salt | 0.174mL | ||
| 10mM EDTA | 100µL | ||
| Streptomycin | 5 | ||
| Penicillin | 6.3 | ||
| 0.5% phenol red | 0.1mL | ||
| L-Glutamine | 14.6 | ||
| MEM Essential Amino Acids | 1mL | ||
| MEM Non-essential AA | 0.5mL | ||
| BSA | 100 | ||
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | culturing embryos |
| Composition of M2: | mg/100mL | ||
| Calcium Chloride | 25.1 | ||
| Magnesium Sulfate (anhydrous) | 16.5 | ||
| Potassium Chloride | 35.6 | ||
| Potassium Phosphate, Monobasic | 16.2 | ||
| Sodium Bicarbonate | 35 | ||
| Sodium Chloride | 553.2 | ||
| Albumin, Bovine Fraction | 400 | ||
| D-Glucose | 100 | ||
| Na-HEPES | 54.3 | ||
| Phenol Red | 1.1 | ||
| Pyruvic Acid | 3.6 | ||
| DL-Lactic Acid | 295 |
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