Laminectomia e impianto della finestra del cavo spinale nel mouse
Summary
Questo protocollo descrive l’impianto di una finestra di vetro sul midollo spinale del mouse per facilitare la visualizzazione mediante microscopia intravitale.
Abstract
Questo protocollo descrive un metodo per la laminectomia del midollo spinale e impianto della finestra di vetro per l’imaging in vivo del midollo spinale del topo. Un vaporizzatore digitale integrato viene utilizzato per ottenere un piano stabile di anestesia a bassa portata di isoflurane. Una singola colonna vertebrale viene rimossa e un vetro di copertura disponibile in commercio viene sovrapposto a un sottile letto di agarose. Una piastra posteriore in plastica stampata in 3D viene quindi apposta sulle spine vertebrali adiacenti utilizzando adesivo tissutale e cemento dentale. Una piattaforma di stabilizzazione viene utilizzata per ridurre l’artefatto di movimento dalla respirazione e dal battito cardiaco. Questo metodo rapido e senza morsetti è adatto per la microscopia acuta multi-fotone a fluorescenza. I dati rappresentativi sono inclusi per un’applicazione di questa tecnica alla microscopia a due fotoni della vascolatura del midollo spinale in topi transgenici che esprimono eGFP:Claudin-5 – una proteina di giunzione stretta.
Introduction
I modelli animali transgenici che esprimono proteine fluorescenti, se combinati con la microscopia intravitale, forniscono una potente piattaforma per affrontare la biologia e la fisiopatologia. Per applicare queste tecniche al midollo spinale, sono necessari protocolli specializzati per preparare il midollo spinale per l’imaging. Una di queste strategie è quella di condurre un impianto della laminectomia e del midollo spinale. Le caratteristiche principali di un protocollo ideale di microscopia includono la conservazione della struttura e della funzione del tessuto nativo, la stabilità del campo di imaging, il tempo di elaborazione rapido e la riproducibilità dei risultati. Una sfida particolare consiste nello stabilizzare il campo di imaging contro il movimento indotto dalla respirazione e dal battito cardiaco. Sono state riportate diverse strategie ex vivo e in vivo per raggiungere questi obiettivi1,2,3,4,5. La maggior parte dei metodi in vivo prevede il bloccaggio dei lati della colonna vertebrale2,4 ed è spesso seguito dall’impianto di un apparato metallico rigido3,4 per la stabilità durante l’intervento chirurgico e applicazioni di imaging a valle. Bloccare la colonna vertebrale può potenzialmente compromettere il flusso sanguigno e indurre il rimodellamento della proteina emato-encefalica (BBB).
Lo scopo di questo metodo è quello di rendere il midollo spinale intatto disponibile per l’imaging ottico nel topo vivente riducendo al minimo l’invasività del protocollo e migliorando i risultati. Descriviamo una singola procedura di impianto di laminectomia e vetro coperto abbinata a una piastra posteriore stampata in plastica ovale minimamente invasiva che raggiunge ancora una robusta stabilità meccanica. La piastra posteriore è direttamente aderisceto alle spine vertebrali anteriori e posteriori con cemento dentale. La piastra posteriore è dotata di bracci di estensione laterali con fori a vite che si attaccano rigidamente allo stadio del microscopio tramite un braccio metallico. Questo ancora efficacemente la vertebra anteriore e posteriore intatta allo stadio del microscopio, fornendo resistenza meccanica al manufatto di movimento che altrimenti sarebbe introdotto dalla respirazione e dal battito cardiaco. Il metodo è stato ottimizzato per la laminectomia di una singola vertebra al livello toracico 12, omettendo i morsetti utilizzati in strategie alternative per la stabilità durante l’imaging in vivo. La procedura è rapida, prendendo circa 30 min per mouse.
Questo protocollo può essere utilizzato per studiare i meccanismi della malattia della BBB. Il BBB è un sistema microvascolare dinamico composto da cellule endoteliali, muscoli lisci vascolari, periciti e processi del piede astrocito che forniscono un ambiente altamente selettivo per il sistema nervoso centrale (SNC). I dati rappresentativi descrivono l’applicazione di questo protocollo in topi transgenici progettati per esprimere proteine fluorescenti verdi potenziate (eGFP):Claudin-5, una proteina di giunzione stretta BBB. I file di stampa backplate forniti possono anche essere personalizzati per applicazioni alternative.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo qui descritto consente l’imaging stabile del midollo spinale nei topi attraverso una finestra di vetro. Questo metodo è stato applicato per valutare il rimodellamento BBB in topi transgenici eGFP:Claudin5/- che esprimono una proteina di giunzione bBB fluorescente, ma potrebbe essere applicato altrettanto bene per gli studi su eventuali proteine fluorescenti o cellule nel midollo spinale.
Sono stati sviluppati diversi metodi per laminectomia e stabilizzazione del midollo spinale. Tut…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.E. Lutz è supportato dal National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, sotto Grant KL2TR002002 e dai fondi di start-up dell’Università dell’Illinois Chicago College of Medicine. Simon Alford è supportato da RO1 MH084874. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali della NIH. Gli autori ringraziano Dritan Agalliu nel Dipartimento di Neurologia del Columbia University Medical Center per i topi Tg eGFP:Claudin-5, discussioni scientifiche e approfondimenti sullo sviluppo del protocollo chirurgico e delle applicazioni di imaging. Gli autori ringraziano Sunil P. Gandhi del Dipartimento di Neurobiologia e Comportamento dell’Università della California, Irvine per aver progettato il primo prototipo dell’apparato stereotassico e del controllore della temperatura animale, la discussione del protocollo chirurgico e formazione in microscopia a due fotoni. Gli autori ringraziano anche Steve Pickens (W. Nuhsbaum, Inc.) per l’assistenza nella personalizzazione dello stereomicroscopio chirurgico, e Ron Lipinski (Whale Manufacturing) per la lavorazione delle parti stereotassiche.
Materials
| 3D printer | Raise3D | Pro2 | For printing backplates |
| PLA 3D printing filament | Inland | PLA+-175-B | Black plastic 3D printing material |
| 3D CAD software | Dassault Systemes | Solidworks software | used to design 3D shapes |
| 3D printer software | Raise3D | Ideamaker software | software used to interface with the 3D printer |
| 3D printed oval backplate | custom | Stabilizing imaging field | |
| Surgical dissecting microscope | Leica | M205 C | Equipped with Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-series objective, and gliding stage |
| Microscope camera | Leica | MC170 | HD color camera for visualizing surgical field |
| Gliding stage | Leica | 10446301 | The gliding stage is constructed of two metal plates. The base plate is fixed. The upper plate slides on greased interface to allow rotational and linear movement. |
| Surgical station and stabilization fork | Whale Manufactoring | custom | Laminectomy |
| SomnoSuite low-flow isoflurane delivery unit | Kent Scientific | SS-01 | Surgical anesthesia administration with integrated digitial vaporizer |
| Stainless steel 1.5 inch mounting post | ThorLabs | P50/M | For mounting surgical station onto optical table for two-photon imaging |
| Counterbored Clamping Fork for 1.5" mounting Post | ThorLabs | PF175 | For stabilizing surgical station mount onto optical table for two-photon imaging |
| Ideal bone microdrill | Harvard apparatus | 72-6065 | Thinning bone for laminectomy |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | Warming saline |
| Cautery gun | FST | 18010-00 | Cauterizing minor bleeds |
| Heating pad | Benchmark | BF11222 | 1.9” x 4.5” silicone heater with 20” Teflon leads, 10W, 5V |
| K type thermocoupled rectal probe | Physitemp | RET3 | Measuring mouse body temperature |
| petroleum jelly | Sigma | 8009-03-8 | Lubricating rectal probe |
| Feedback-regulated thermal controller | custom | NA | Commercially available alternatives include the Physitemp TCAT series |
| PVA Surgical eye spears | Beaver-visitec international | 40400-8 | Absorbing blood |
| Electric trimmer | Wahl | 41590-0438 | Trimming mouse fur |
| Blade, #11 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Forceps, #5 | FST | 11254-20 | Surgical tool |
| Forceps, #4 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Titatnium toothed forceps | WPI | 555047FT | Surgical tool |
| Titanium Iris scissors | WPI | 555562S | Surgical tool |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 084-1469SB | Preparing tissue surface for dental acrylic |
| Ceramic mixing tray | Jack Richeson | 420716 | Mixing dental acrylic agent with accelerant |
| Orthojet dental acrylic | Lang Dental | 1520BLK, 1503BLK | Permanently bonding backplate to tissue |
| Small round cover glass, #1 thickness, 3 mm | Harvard apparatus | 64-0720 | optical window |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | For aCSF |
| KCl | Fisher Scientific | 7447-40-7 | For aCSF |
| Glucose | Fisher Scientific | 50-99-7 | For aCSF |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | For aCSF |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | For aCSF |
| CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | For aCSF |
| Carprofen | Rimadyl | QM01AE91 | Analgesia |
| Bacteriostatic water | Henry Schein | 2587428 | Diluent for carprofen |
| Isoflurane | Henry Schein | 11695-6776-2 | Anesthesia |
| Lactated ringer solution | Baxter | 0338-0117-04 | Hydration for mouse |
| Agarose High EEO | Sigma | A9793 | gel point 34-37 degrees C |
| Opthalmic lubricating ointment | Akwa Tears | 68788-0697 | Prevent corneal drying |
| MOM Two-Photon Microscope | Sutter |
Referências
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