Laminektomi og rygmarv vindue implantation i musen
Summary
Denne protokol beskriver implantation af et glas vindue på rygmarven af en mus for at lette visualisering ved intravital mikroskopi.
Abstract
Denne protokol beskriver en metode til rygmarven laminektomi og glas Vindues implantation for in vivo billeddannelse af muse rygmarven. En integreret digital vaporizer udnyttes til at opnå en stabil plan af anæstesi på en lav-flowhastighed af isofluran. En enkelt rygsøjle er fjernet, og et kommercielt tilgængeligt dækglas er overlagt på en tynd agopstået seng. En 3D-trykt plastik bagplade er derefter fastgjort til de tilstødende vertebrale spines ved hjælp af vævsklæber og dental cement. En stabiliserings platform bruges til at reducere bevægelses artefakt fra respiration og hjerteslag. Denne hurtige og clamp-fri metode er velegnet til akut multifoton Fluorescens mikroskopi. Repræsentative data er inkluderet for en anvendelse af denne teknik til to-foton mikroskopi af rygmarven Vaskulaturen i Transgene mus, der udtrykker egfp: claudin-5-et stramt samle protein.
Introduction
Transgene dyremodeller, der udtrykker fluorescerende proteiner, når de kombineres med intravital mikroskopi, giver en stærk platform til håndtering af biologi og patofysiologi. For at anvende disse teknikker til rygmarven, er specialiserede protokoller forpligtet til at forberede rygmarven til billeddannelse. En sådan strategi er at gennemføre en laminektomi og rygmarven vindue implantation. De vigtigste funktioner i en ideel laminektomi protokol til mikroskopi omfatter bevarelse af indfødte væv struktur og funktion, stabilitet af billedbehandlings feltet, hurtig behandlingstid, og reproducerbarhed af resultater. En særlig udfordring er at stabilisere billedfeltet mod bevægelsen induceret af respiration og hjerteslag. Flere ex vivo og in vivo strategier er blevet rapporteret til at nå disse mål1,2,3,4,5. De fleste in vivo metoder involverer fastspænding af siderne af rygsøjlen2,4 og er ofte efterfulgt af implantering af et stift metal apparat3,4 for stabilitet under kirurgi og downstream-billedbehandlings applikationer. Fastspænding rygsøjle kan potentielt kompromittere blodgennemstrømningen og inducere blod-hjerne barrieren (BBB) protein remodeling.
Formålet med denne metode er at gøre den intakte rygmarv til rådighed for optisk billeddannelse i levende mus samtidig minimere invasivitet af protokollen og forbedre resultaterne. Vi beskriver en enkelt laminektomi og Cover-Glass implantation procedure parret med en minimalt invasiv oval plast 3D-printet bagplade, der stadig opnår robust mekanisk stabilitet. Bagpladen overholdes direkte til de forreste og bageste vertebrale Spiner med Dental cement. Bagpladen er udstyret med laterale forlængerarme med skruehuller, der stift Fastgør til mikroskop scenen via en metalarm. Dette forankrer effektivt den intakte forreste og bageste hvirvlen til mikroskopet, hvilket giver mekanisk modstandsdygtighed over for bevægelses artefakt, der ellers ville blive introduceret ved respiration og hjerteslag. Metoden er blevet optimeret til laminektomi af en enkelt hvirvel på thorax niveau 12, udelade de klemmer, der anvendes i alternative strategier for stabilitet under in vivo Imaging. Proceduren er hurtig, tager ca 30 min per mus.
Denne protokol kan bruges til at studere sygdomsmekanismer af BBB. BBB er et dynamisk mikrovaskulære system bestående af endotelceller, vaskulære glatte muskler, pericytes, og astrocyt Foot processer, der giver et meget selektivt miljø for centralnervesystemet (CNS). Repræsentative data viser anvendelsen af denne protokol i Transgene mus konstrueret til at udtrykke forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP): Claudin-5, en BBB stramt Junction protein. De medfølgende bagplade udskrivnings filer kan også tilpasses til alternative applikationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den metode, der er beskrevet her, giver mulighed for stabil billeddannelse af rygmarven i mus gennem et glas vindue. Denne metode er blevet anvendt til at vurdere BBB remodeling i transgene eGFP: Claudin5 +/-mus, der udtrykker en fluorescerende BBB stramt Junction protein, men det kunne anvendes lige så godt for undersøgelser af eventuelle fluorescerende proteiner eller celler i rygmarven.
Flere metoder til laminektomi og rygmarvs stabilisering er blevet udviklet. Alle protokoller adresse st…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.E. Lutz er støttet af det nationale center for fremme translational Sciences, nationale institutter for sundhed, under Grant KL2TR002002 og University of Illinois Chicago College of Medicine start-up midler. Simon Alford understøttes af RO1 MH084874. Indholdet er udelukkende ansvaret for forfatterne og ikke nødvendigvis repræsenterer de officielle synspunkter af NIH. Forfatterne tak Dritan Agalliu i Department of Neurology på Columbia University Medical Center for TG eGFP: Claudin-5 mus, videnskabelige diskussioner, og indsigt i udviklingen af den kirurgiske protokol og Imaging applikationer. Forfatterne tak Sunil P. Gandhi i Department of Neurobiology og Behavior på University of California, Irvine for at designe den første prototype af stereoanlæg og dyre temperatur controller, diskussion af den kirurgiske protokol, og træning i to-foton mikroskopi. Forfatterne takker også Steve Pickens (W. Nuhsbaum, Inc.) for at hjælpe med at tilpasse det kirurgiske stereomicroskop og Ron Lipinski (hval fremstilling) til bearbejdning af stereotaktiske dele.
Materials
| 3D printer | Raise3D | Pro2 | For printing backplates |
| PLA 3D printing filament | Inland | PLA+-175-B | Black plastic 3D printing material |
| 3D CAD software | Dassault Systemes | Solidworks software | used to design 3D shapes |
| 3D printer software | Raise3D | Ideamaker software | software used to interface with the 3D printer |
| 3D printed oval backplate | custom | Stabilizing imaging field | |
| Surgical dissecting microscope | Leica | M205 C | Equipped with Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-series objective, and gliding stage |
| Microscope camera | Leica | MC170 | HD color camera for visualizing surgical field |
| Gliding stage | Leica | 10446301 | The gliding stage is constructed of two metal plates. The base plate is fixed. The upper plate slides on greased interface to allow rotational and linear movement. |
| Surgical station and stabilization fork | Whale Manufactoring | custom | Laminectomy |
| SomnoSuite low-flow isoflurane delivery unit | Kent Scientific | SS-01 | Surgical anesthesia administration with integrated digitial vaporizer |
| Stainless steel 1.5 inch mounting post | ThorLabs | P50/M | For mounting surgical station onto optical table for two-photon imaging |
| Counterbored Clamping Fork for 1.5" mounting Post | ThorLabs | PF175 | For stabilizing surgical station mount onto optical table for two-photon imaging |
| Ideal bone microdrill | Harvard apparatus | 72-6065 | Thinning bone for laminectomy |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | Warming saline |
| Cautery gun | FST | 18010-00 | Cauterizing minor bleeds |
| Heating pad | Benchmark | BF11222 | 1.9” x 4.5” silicone heater with 20” Teflon leads, 10W, 5V |
| K type thermocoupled rectal probe | Physitemp | RET3 | Measuring mouse body temperature |
| petroleum jelly | Sigma | 8009-03-8 | Lubricating rectal probe |
| Feedback-regulated thermal controller | custom | NA | Commercially available alternatives include the Physitemp TCAT series |
| PVA Surgical eye spears | Beaver-visitec international | 40400-8 | Absorbing blood |
| Electric trimmer | Wahl | 41590-0438 | Trimming mouse fur |
| Blade, #11 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Forceps, #5 | FST | 11254-20 | Surgical tool |
| Forceps, #4 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Titatnium toothed forceps | WPI | 555047FT | Surgical tool |
| Titanium Iris scissors | WPI | 555562S | Surgical tool |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 084-1469SB | Preparing tissue surface for dental acrylic |
| Ceramic mixing tray | Jack Richeson | 420716 | Mixing dental acrylic agent with accelerant |
| Orthojet dental acrylic | Lang Dental | 1520BLK, 1503BLK | Permanently bonding backplate to tissue |
| Small round cover glass, #1 thickness, 3 mm | Harvard apparatus | 64-0720 | optical window |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | For aCSF |
| KCl | Fisher Scientific | 7447-40-7 | For aCSF |
| Glucose | Fisher Scientific | 50-99-7 | For aCSF |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | For aCSF |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | For aCSF |
| CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | For aCSF |
| Carprofen | Rimadyl | QM01AE91 | Analgesia |
| Bacteriostatic water | Henry Schein | 2587428 | Diluent for carprofen |
| Isoflurane | Henry Schein | 11695-6776-2 | Anesthesia |
| Lactated ringer solution | Baxter | 0338-0117-04 | Hydration for mouse |
| Agarose High EEO | Sigma | A9793 | gel point 34-37 degrees C |
| Opthalmic lubricating ointment | Akwa Tears | 68788-0697 | Prevent corneal drying |
| MOM Two-Photon Microscope | Sutter |
Referências
- Weinger, J. G., et al. Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), (2012).
- Farrar, M. J., Schaffer, C. B. A procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. (82), e50826 (2013).
- Figley, S. A., et al. A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model. PLOS ONE. 8 (3), e58081 (2013).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135 (3), 311-336 (2018).
- Shen, L., Weber, C. R., Turner, J. R. The tight junction protein complex undergoes rapid and continuous molecular remodeling at steady state. Journal of Cell Biology. 181 (4), 683-695 (2008).
- Knowland, D., et al. Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke. Neuron. 82, 1-15 (2014).
- Lutz, S. E., et al. Caveolin1 Is Required for Th1 Cell Infiltration, but Not Tight Junction Remodeling, at the Blood-Brain Barrier in Autoimmune Neuroinflammation. Cell Reports. 21 (8), 2104-2117 (2017).
- Harrison, M., et al. Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse. Neuroimage. 68, 22-29 (2013).
- Cupido, A., Catalin, B., Steffens, H., Kirchhoff, F., Bakota, L., Brandt, R. . Laser Scanning Microscopy and Quantitative Image Analysis of Neuronal Tissue. , 37-50 (2014).
- Sekiguchi, K. J., et al. Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice. Nature Communications. 7, 11450 (2016).
- Nadrigny, F., Le Meur, K., Schomburg, E. D., Safavi-Abbasi, S., Dibaj, P. Two-photon laser-scanning microscopy for single and repetitive imaging of dorsal and lateral spinal white matter in vivo. Physiological Research. 66 (3), 531-537 (2017).
- Adelsperger, A. R., Bigiarelli-Nogas, K. J., Toore, I., Goergen, C. J. Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Damen, F. W., Adelsperger, A. R., Wilson, K. E., Goergen, C. J. Comparison of Traditional and Integrated Digital Anesthetic Vaporizers. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 756-762 (2015).
- Miyamoto, K., et al. Selective COX-2 inhibitor celecoxib prevents experimental autoimmune encephalomyelitis through COX-2-independent pathway. Brain. 129 (Pt 8), 1984-1992 (2006).
- Muthian, G., et al. COX-2 inhibitors modulate IL-12 signaling through JAK-STAT pathway leading to Th1 response in experimental allergic encephalomyelitis. Journal of Clinical Immunology. 26 (1), 73-85 (2006).
