Medição de alto rendimento da membrana plasmática, efectuou a eficiência em células de mamíferos

Resumo

Aqui nós descrevemos um alta produtividade baseada em fluorescência do ensaio que mede a membrana plasmática, efectuou a eficiência por meio de análises fluorométrica e da imagem latente em células vivas. Este ensaio pode ser usado para triagem de drogas ou genes-alvo que regulam a membrana plasmática de fechamento em células de mamíferos.

Resumo

Em seu ambiente fisiológico, células de mamíferos são frequentemente sujeitas a tensões mecânicas e bioquímicas que resultam em danos de membrana plasmática. Em resposta a esses danos, máquinas moleculares complexas rapidamente selar novamente a membrana plasmática para restaurar a sua função de barreira e manter a sobrevivência da pilha. Apesar de 60 anos de investigação neste domínio, ainda falta uma compreensão completa da célula máquinas de fechamento. Com o objetivo de identificar componentes celulares que controle de fechamento de membrana plasmática ou drogas que podem melhorar a recelagem, nós desenvolvemos um ensaio de alto rendimento baseada em fluorescência que mede a membrana plasmática recelagem eficiência em células de mamíferos cultivadas em microplacas. Como um sistema modelo para danos de membrana plasmática, as células estão expostas à bactérias formadoras de poros toxina listeriolisina O (LLO), que forma grandes 30-50 nm de diâmetro proteicas poros em colesterol, contendo membranas. O uso de um leitor de microplacas de modo multi temperatura controlada permite medições de spectrofluorometric rápida e sensível, em combinação com brightfield e imagem de microscopia de fluorescência das células vivas. Análise cinética da intensidade da fluorescência emitida pelo fluorocromo impermeant de ácido nucleico-ligação membrana reflete a extensão da membrana, ferindo e efectuou no nível da população de célula, permitindo o cálculo da célula eficiência de fechamento . Imagem de microscopia de fluorescência permite a enumeração de células, que constitutivamente expressa uma quimera fluorescente de 2B de histona a proteína nuclear, em cada poço do microplate em conta possíveis variações em seu número e permite a eventual identificação de populações de células distintas. Este ensaio de alto rendimento é uma ferramenta poderosa, espera-se expandir a nossa compreensão dos mecanismos de reparação de membrana através de triagem para genes do hospedeiro ou exogenamente adicionados compostos que efectuou de membrana plasmática de controle.

Introdução

Células de mamíferos estão sujeitos a estresse mecânico, osmótico e bioquímico, resultando na perda da integridade da membrana plasmática. Sem rápida e eficiente de fechamento, células danificadas rapidamente iria sucumbir à morte programada ou necrótica. Desde a década de 1960, os esforços para compreender a membrana de plasma nesse processo tem sido motivados pelas consequências devastadoras associadas com suas disfunções. Na verdade, doenças como Distrofia Muscular de membro-cinta, diabetes e síndrome de Chediak-Higashi têm sido associadas a reparação da membrana de plasma deficiente devido a mutações no gene dysferlin codificação, produção de produtos finais de gl....

Protocolo

1. preparação

1. Chapeamento de célula
   Nota: Células epiteliais do colo do útero humanas, HeLa e HeLa expressando histona 2B-GFP (H2B-GFP), foram utilizadas neste protocolo, mas este ensaio pode ser adaptado a outras células de mamíferos,¹⁹.
   1. Separe células aderentes de um frasco de cultura de células de² 75cm lavando as células com 2 mL de EDTA-tripsina 0,25%. Substitua a tripsina usada com 2 mL de fresco do trypsin-EDTA 0,25%.
   2. Incube as celulas em 37 ˚ c por 5 min até as células arredondadas e retirado o balão.
   3. Ressuspender as células em 8 mL de meio de cultura (DMEM contendo 10% inactivadas p....

Resultados

Célula, contando com precisão: as células HeLa são usadas frequentemente como uma linha de células de mamíferos do modelo para explorar mecanismos de reparação da membrana. Ao avaliar a reparação da membrana no nível da população de célula, é importante para as células da placa na mesma concentração em todos os poços para interpretação de dados apropriados. Também é importante verificar no momento do ensaio que celulares sejam equivalentes em poços. Células HeLa que expressam constitutiva.......

Discussão

Este ensaio mede a eficiência da membrana efectuou a nível de população de células com capacidade de alta produtividade. Pode ser usada para triagem de bibliotecas de drogas que poderiam afetar a reparação da membrana ou componentes celulares. O ensaio descrito usado um formato de placa de 96 poços, mas pode ser adaptado para placas boas 384 para maior rendimento. Uma vantagem deste teste é sua capacidade de obter medidas de fluorescência das células vivas aderentes em tempo real sem a necessidade de célula excessiva pro.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader	Molecular Devices	i3x
MiniMax 300 Imaging cytometer	Molecular Devices	5024062
TO-PRO-3	ThermoFisher Scientific	T3605
Propidium Iodide	ThermoFisher Scientific	P3566
HeLa	ATCC	CCL2
HeLa H2B-GFP	Millipore	SCC117
Tripsina-EDTA 0,25%	ThermoFisher Scientific	25200056
96 poços Corning placa tratada com cultura de tecidos de poliestireno preto de fundo plano	Corning	3603
Sais balanceados de Hanks	Sigma-Aldrich	H4891
EGTA	ISC BioExpress	0732-100G
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
D-(+)-Glicose, HybriMax	Sigma-Aldrich	G5146-1KG