Bildebehandling celle interaksjon i Tracheal Mucosa under influensa Virus smitte med to-fotonet Intravital mikroskopi

Summary

I denne studien presenterer vi en protokoll for å utføre to-fotonet intravital imaging og celle samhandling analyse i murine tracheal mucosa etter infeksjon med influensavirus. Denne protokollen vil være relevant for forskere studere immun celle dynamics under luftveisinfeksjoner.

Abstract

Analyse av celle-celle eller cellen-patogen samhandling i vivo er et viktig verktøy for å forstå dynamikken i immun respons på infeksjon. To-fotonet intravital mikroskopi (2P-IVM) gir observasjon av cellen interaksjoner i dype vev i levende dyr, samtidig som photobleaching genereres under bildeopptak. Ulike modeller for 2P-IVM av lymfoide og ikke-lymfoide organer er beskrevet hittil. Bildebehandling åndedretts organer er imidlertid en utfordring på grunn av bevegelsen knyttet pust syklusen av dyret.

Her beskriver vi en protokoll for å visualisere i vivo immun celle interaksjoner i luftrøret mus infisert med influensavirus benytter 2 P-IVM. Til dette formålet utviklet vi en egendefinert tenkelig plattform, som inkluderte kirurgisk eksponering og intubasjon av trachea, etterfulgt av oppkjøpet av dynamiske bilder av nøytrofile og dendrittiske celler (DC) i slimhinnene epitel. I tillegg detaljerte vi trinnene for å utføre influensa intranasal infeksjon og flyt cytometric analyse av immunceller i luftrøret. Til slutt, vi analyserte nøytrofile og DC motilitet samt deres samspill i løpet av en film. Denne protokollen tillater generering av stabile og lyse 4D-bilder nødvendig for å vurdere celle-celle interaksjoner i luftrøret.

Introduction

To-fotonet intravital mikroskopi (2P-IVM) er en effektiv teknikk for sanntid tenkelig celle til celle samhandlinger som de forekommer i deres naturlige miljø¹. En av de viktigste fordelene med denne metoden er at det tillater studiet av cellulære prosesser på en større prøven dybde (500 µm til 1 mm) sammenlignet med andre tradisjonelle imaging teknikker². Samtidig minimerer bruk av to lav-energi fotoner generert av to-fotonet laser vev Foto-skade vanligvis assosiert med bilde oppkjøpet prosessen². I løpet av det siste tiåret, er 2P-IVM brukt for å studere ulike typer celle-celle interaksjoner i flere disipliner^3,4,5. Disse studiene har blitt spesielt relevant å undersøke immunceller, som er preget av deres høy dynamikk og dannelsen av fremtredende kontakter etter signalene generert av andre celler og miljø. 2P-IVM er også brukt for å studere interaksjonen mellom patogen og vert⁶. Faktisk har det tidligere vist at noen patogener kan endre type og varighet av kontaktene mellom immunceller, hindrer, resultatet av immunrespons⁷.

Luftveiene mucosa er det første stedet der immunrespons mot luftbårne patogener er generert⁸. I vivo analyse av patogen vert interaksjoner i dette vevet er derfor avgjørende å forstå initiering av forsvarsmekanismer vert under infeksjon. Men er 2P-IVM i luftveiene utfordrende skyldes gjenstander produsert av puste syklusen av dyret, som truer prosessen med bildeopptak. Nylig har ulike kirurgisk modeller blitt beskrevet for bildebehandling murine luftrøret^9,10,11,12 og lungene^{13,14,15, 16}. Tracheal 2P-IVM modeller representerer en utmerket oppsett å visualisere den innledende fasen av immunreaksjon i øvre luftveiene, mens lunge-alveoler 2P-IVM modeller er mer egnet til å studere den sene fasen av infeksjoner. Utviklet lunge modellene presentere en begrensning assosiert med tilstedeværelse av luftfylte alveoler, som begrenser optisk gjennomtrengning av laser og gjøre den slimhinnene lag i intrapulmonary luftveiene utilgjengelig for i vivo imaging¹⁷ . Omvendt, strukturen i luftrøret, dannet av en kontinuerlig epitel, forenkler bildeopptak.

Her presenterer vi en protokoll som inneholder en detaljert beskrivelse av trinn kreves for å utføre influensa infeksjon, kirurgisk utarbeidelse av dyrene, og 2P-IVM av trachea. I tillegg beskriver vi en bestemt eksperimentelle oppsett for visualisering av nøytrofile og dendrittiske celler (DC), to immun celletyper som spiller en viktig rolle som meglere på forsvar mekanisme mot influensa virus^18,19 . Til slutt, vi beskriver en prosedyre for å analysere nøytrofile-DC interaksjoner. Kontaktene har vist seg å modulere DC aktivisering og, senere, å påvirke immunreaksjoner mot patogener²⁰.

Protocol

Alle dyr prosedyrer som involverer mus ble utført i henhold til sveitsiske føderale veterinær kontor retningslinjer og dyr protokollene ble godkjent av lokale veterinær myndighetene. 1. influensa infeksjon av CD11c-YFP mus BiosikkerhetMerk: Mus tilpasset belastningen av influensa A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) var vokst befruktede egg, renset og titreres som beskrevet tidligere21. Alle foranstaltningene innvolvere infiserte dyr eller bi…

Representative Results

I dette arbeidet beskrev vi en detaljert protokoll for å studere i vivo motilitet og samspillet mellom nøytrofile og DC under influensa infeksjon i murine luftrøret (figur 3A). Til dette formålet isolerte vi CFP+ nøytrofile (92% renhet; Figur 3B) fra CK6-ECFP overført mus og vi adoptively dem til en CD11c-YFP mus infisert med influensa. Etter at spilte vi 2P-IVM av trachea på dag 3 p.i. På dette tidspu…

Discussion

Dette arbeidet gir en detaljert protokoll for generering av 4D-bilder viser overføringen av adoptively overførte nøytrofile og deres samspill med fm under en influensa infeksjon i musen luftrøret. Beskrevet 2P-IVM modell vil være relevant å studere immun celle dynamics under en infeksjon i luftveiene.

Nylig har flere modeller basert på visualisering av cellen dynamikk i luftveiene vært utviklet^9,10,…

Materials

Gigasept instru AF	Schülke & Mayr GmbH		4% solution
CD11c-YFP mice	Jackson Laboratories	008829	mice were bred in-house
CK6-ECFP mice	Jackson Laboratories	004218	mice were bred in-house
1 X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride	Sigma	D8537-500ML
10 X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride	Sigma	D1408-500ML
Percoll PLUS	Sigma	E0414-1L	Store at 4°C
Ketamin Labatec	Labatec Pharma	7680632310024	Store at RT, store at 4°C when in solution of ket/xyl mixture
Rompun 2% (Xylazin)	Bayer	6293841.00.00	Store at RT, store at 4°C when in solution of ket/xyl mixture
26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak	BD Plastipak	305501
30 G 0,3 mL BD Micro-Fine Insulin Syringes	BD	324826
Falcon 40 µm Cell Strainer	Corning	352340
2 mL Syringes	BD Plastipak	300185
Microlance 3 18 G needles	BD	304622
Introcan Safety 20G (catheter)	Braun	4251652.01
6 Well Cell Culture Cluster	Costar	3516
RPMI medium 1640 + HEPES (1X)	ThermoFisher Scientific	42401-018	Store at 4°C
Liberase TL Research Grade	Roche	5401020001	Store at -20°C / collagenase (I and II) mixture
DNAse I	Amresco (VWR)	0649-50KU	Store at -20°C
CellTrace Violet stain	ThermoFisher Scientific	C34557	Store at -20°C
EDTA	Sigma	EDS-500G
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106	Store at -20°C
PE-10 Micro Medical Tubing	2Biological Instruments SNC	#BB31695-PE/1
Surgical Plastic Tape	M Plast
Viscotears	Bausch & Lomb		Store at RT
Plasticine	Ohropax
High Tolerance Glass Coverslip 15mm Round	Warner Instruments	64-0733
SomnoSuite Portable Animal Anesthesia System	Kent Scientific	SS-01
Nuvo Lite mark 5	GCE medline	14111211
MiniTag (gaseous anesthesia and heating bench)	Tem Sega
SURGICAL BOARD	University of Bern
TrimScope II Two-photon microscope	LaVision Biotec
Chameleon Vision Ti:Sa lasers	Coherent Inc.
25X NA 1.05 water immersion objective	Olympus	XLPLN25XWMP2
The Cube&The Box incubation chamber and temperature controller	Life imaging Services
Imaris 9.1.0	Bitplane		Imaging software
GraphPad Prism 7	GraphPad		Statistical software