Imaging-cel interactie in tracheale Mucosa tijdens Influenza virusinfectie met behulp van twee-foton Intravital microscopie
Summary
In deze studie presenteren we een protocol voor het uitvoeren van twee-foton intravital beeldvorming en cel interactie analyse in de lymfkliertest tracheale mucosa na infectie met influenzavirus. Dit protocol is relevant voor onderzoekers bestuderen immuun cel dynamiek tijdens infecties van de luchtwegen.
Abstract
De analyse van de cel of cel-ziekteverwekker interactie in vivo is een belangrijk instrument om te begrijpen de dynamiek van de immune reactie op de infectie. Twee-foton intravital microscopie (2P-GODT) kan de waarneming van cel interacties in diepe weefsel in levende dieren, terwijl het minimaliseren van de photobleaching gegenereerd tijdens Beeldacquisitie. Tot op heden zijn verschillende modellen voor 2P-GODT van lymfoïde en niet-lymfoïde organen beschreven. Beeldvorming van de ademhalingsorganen blijft echter een uitdaging als gevolg van de beweging die is gekoppeld aan de ademhaling cyclus van het dier.
Hier beschrijven we een protocol om te visualiseren in vivo immuun cel interacties in de luchtpijp van muizen geïnfecteerd met influenza-virus met behulp van 2 P-GODT. Hiervoor ontwikkelden we een aangepaste imaging platform, waaronder de chirurgische blootstelling en intubatie van de luchtpijp, gevolgd door de overname van dynamische beelden van neutrofielen en dendritische cellen (DC) in de mucosal epitheel. Bovendien, gedetailleerde we de stappen die nodig zijn voor het uitvoeren van influenza intranasale infectie en stroom cytometrische analyse van immuuncellen in de luchtpijp. Ten slotte, geanalyseerd wij neutrofiele en beweeglijkheid van de DC, evenals hun interacties in de loop van een film. Dit protocol zorgt voor de generatie van stabiel en helder 4D beelden nodig zijn voor de beoordeling van cel-cel-interacties in de luchtpijp.
Introduction
Twee-foton intravital microscopie (2P-GODT) is een effectieve techniek voor real-time imaging van cel naar cel interacties zoals die in hun natuurlijke omgeving1plaatsvinden. Een van de belangrijkste voordelen van deze methode is dat het mogelijk de studie van cellulaire processen op een groter model diepte (500 µm tot 1 mm maakt) in vergelijking met andere traditionele beeldvormende technieken2. Op hetzelfde moment minimaliseert het gebruik van twee lage-energie fotonen gegenereerd door de twee-foton laser de foto-weefselschade meestal gekoppeld aan de afbeelding acquisitie proces2. Tijdens het laatste decennium is 2P-GODT toegepast om te bestuderen van de verschillende types van cel-cel-interacties in de verschillende disciplines-3,–4,5. Deze studies zijn met name relevant zijn voor het onderzoeken van immune cellen, die worden gekenmerkt door hun hoge dynamiek en de vorming van prominente contacten na de signalen gegenereerd door andere cellen en het milieu. 2P-GODT is ook toegepast om te bestuderen van de interacties tussen pathogene en host6. Inderdaad, het is eerder aangetoond dat sommige ziekteverwekkers veranderen als kunnen het type en de duur van de contacten tussen immune cellen, belemmeren, dientengevolge, de immuunrespons7.
De mucosa van de luchtwegen is de eerste site die de immuunrespons tegen lucht ziekteverwekkers zich gegenereerd8. Daarom, in vivo analyse van pathogene agens-gastheer interacties in dit weefsel is kritiek te begrijpen van de inleiding van de afweermechanismen van de host tijdens de infectie. 2P-GODT van de luchtwegen is echter uitdagende voornamelijk te wijten aan de artefacten geproduceerd door de ademhaling cyclus van het dier, dat het proces van Beeldacquisitie compromissen. Onlangs, verschillende chirurgische modellen zijn beschreven voor imaging lymfkliertest luchtpijp9,10,11,12 en longen13,14,15, 16. De tracheale 2P-GODT modellen vertegenwoordigen een uitstekende set-up om te visualiseren van de beginfase van de immune reactie in de bovenste luchtwegen, terwijl de Long-longblaasjes 2P-GODT modellen zijn meer geschikt voor het bestuderen van de late fase van infecties. De ontwikkelde longen modellen presenteren een beperking die zijn gekoppeld aan de aanwezigheid van lucht gevulde longblaasjes, waardoor de optische penetratie van de laser worden beperkt en maak de mucosal laag van de intrapulmonary airways ontoegankelijk voor in vivo imaging17 . De structuur van de luchtpijp, gevormd door een continue epitheel, vergemakkelijkt daarentegen Beeldacquisitie.
Hier presenteren we een protocol dat een gedetailleerde beschrijving van de stappen die nodig zijn bevat voor het uitvoeren van de besmetting van de griep, chirurgische voorbereiding van de dieren, en 2P-GODT van de luchtpijp. Daarnaast beschrijven we een specifieke experimentele opstelling voor de visualisatie van neutrofielen en dendritische cellen (DC), twee soorten van immuun cellen die een belangrijke rol als bemiddelaars van het afweermechanisme tegen influenza virus18,19 spelen . Ten slotte, beschrijven we een procedure voor het analyseren van neutrofiele-DC interacties. Deze contacten is gebleken moduleren DC activering en vervolgens bij de immuunrespons tegen ziekteverwekkers20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit werk presenteert een gedetailleerd protocol voor de generatie van 4D beelden tonen van de migratie van adoptively overgedragen neutrofielen en hun interacties met DC tijdens een besmetting van de griep in de luchtpijp van de muis. De beschreven 2P-GODT-model zullen relevant zijn voor de studie van immuun cel dynamiek tijdens een infectie in de luchtwegen.
Verschillende modellen gebaseerd op de visualisatie van de dynamiek van de cel in de luchtwegen hebben onlangs ontwikkelde<sup class="xr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de Zwitserse nationale Stichting (SNF) subsidies (176124, 145038 en 148183), de Europese Commissie Marie Curie reïntegratietoelage (612742) en de SystemsX.ch voor een subsidie voor de D.U.P. (2013/124).
Materials
| Gigasept instru AF | Schülke & Mayr GmbH | 4% solution | |
| CD11c-YFP mice | Jackson Laboratories | 008829 | mice were bred in-house |
| CK6-ECFP mice | Jackson Laboratories | 004218 | mice were bred in-house |
| 1 X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride | Sigma | D8537-500ML | |
| 10 X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride | Sigma | D1408-500ML | |
| Percoll PLUS | Sigma | E0414-1L | Store at 4°C |
| Ketamin Labatec | Labatec Pharma | 7680632310024 | Store at RT, store at 4°C when in solution of ket/xyl mixture |
| Rompun 2% (Xylazin) | Bayer | 6293841.00.00 | Store at RT, store at 4°C when in solution of ket/xyl mixture |
| 26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak | BD Plastipak | 305501 | |
| 30 G 0,3 mL BD Micro-Fine Insulin Syringes | BD | 324826 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| 2 mL Syringes | BD Plastipak | 300185 | |
| Microlance 3 18 G needles | BD | 304622 | |
| Introcan Safety 20G (catheter) | Braun | 4251652.01 | |
| 6 Well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| RPMI medium 1640 + HEPES (1X) | ThermoFisher Scientific | 42401-018 | Store at 4°C |
| Liberase TL Research Grade | Roche | 5401020001 | Store at -20°C / collagenase (I and II) mixture |
| DNAse I | Amresco (VWR) | 0649-50KU | Store at -20°C |
| CellTrace Violet stain | ThermoFisher Scientific | C34557 | Store at -20°C |
| EDTA | Sigma | EDS-500G | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | Store at -20°C |
| PE-10 Micro Medical Tubing | 2Biological Instruments SNC | #BB31695-PE/1 | |
| Surgical Plastic Tape | M Plast | ||
| Viscotears | Bausch & Lomb | Store at RT | |
| Plasticine | Ohropax | ||
| High Tolerance Glass Coverslip 15mm Round | Warner Instruments | 64-0733 | |
| SomnoSuite Portable Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-01 | |
| Nuvo Lite mark 5 | GCE medline | 14111211 | |
| MiniTag (gaseous anesthesia and heating bench) | Tem Sega | ||
| SURGICAL BOARD | University of Bern | ||
| TrimScope II Two-photon microscope | LaVision Biotec | ||
| Chameleon Vision Ti:Sa lasers | Coherent Inc. | ||
| 25X NA 1.05 water immersion objective | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| The Cube&The Box incubation chamber and temperature controller | Life imaging Services | ||
| Imaris 9.1.0 | Bitplane | Imaging software | |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad | Statistical software |
Referências
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Fein, M. R., Egeblad, M. Caught in the act: revealing the metastatic process by live imaging. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 580-593 (2013).
- Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).
- Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annual review of immunology. 26, 585-626 (2008).
- Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A Decade of Imaging Cellular Motility and Interaction Dynamics in the Immune System. Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).
- Coombes, J. L., Robey, E. A. Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo. Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).
- Pulendran, B., Maddur, M. S. Innate Immune Sensing and Response to Influenza. Life Science Journal. 6 (4), 23-71 (2014).
- Lim, K., et al. Neutrophil trails guide influenza- specific CD8 + T cells in the airways. Science. 349 (6252), (2015).
- Kim, J. K., et al. In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration. American journal of respiratory cell and molecular biology. 47 (6), 864-868 (2012).
- Kretschmer, S., et al. Autofluorescence multiphoton microscopy for visualization of tissue morphology and cellular dynamics in murine and human airways. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 96 (8), 918-931 (2016).
- Veres, T. Z., et al. Intubation-free in vivo imaging of the tracheal mucosa using two-photon microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 694 (2017).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature. 8 (1), 91-96 (2011).
- Thornton, E. E., Krummel, M. F., Looney, M. R. Live Imaging of the Lung. Current Protocols in Cytometry. 60 (1), (2012).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
- Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
- Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. Intravital microscopy in historic and contemporary immunology. Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).
- Lambrecht, B. N., Hammad, H. Lung Dendritic Cells in Respiratory Viral Infection and Asthma: From Protection to Immunopathology. Annual Review of Immunology. 30 (1), 243-270 (2012).
- Camp, J. V., Jonsson, C. B. A role for neutrophils in viral respiratory disease. Frontiers in Immunology. 8, (2017).
- van Gisbergen, K. P. J. M., Sanchez-Hernandez, M., Geijtenbeek, T. B. H., van Kooyk, Y. Neutrophils mediate immune modulation of dendritic cells through glycosylation-dependent interactions between Mac-1 and DC-SIGN. The Journal of experimental medicine. 201 (8), 1281-1292 (2005).
- Gonzalez, S. F., et al. Capture of influenza by medullary dendritic cells via SIGN-R1 is essential for humoral immunity in draining lymph nodes. Nature Immunology. 11 (5), 427-434 (2010).
- Lindquist, R. L., et al. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nature immunology. 5 (12), 1243-1250 (2004).
- Li, H., et al. Human Vγ9Vδ2-T cells efficiently kill influenza virus-infected lung alveolar epithelial cells. Cellular and Molecular Immunology. 10 (2), 159-164 (2013).
- Tran Cao, H. S., et al. Development of the transgenic cyan fluorescent protein (CFP)-expressing nude mouse for "technicolor" cancer imaging. Journal of Cellular Biochemistry. 107 (2), 328-334 (2009).
- Jaber, S. M., et al. Dose regimens, variability, and complications associated with using repeat-bolus dosing to extend a surgical plane of anesthesia in laboratory mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 53 (6), 684-691 (2014).
- Pizzagalli, D. U., et al. Leukocyte Tracking Database, a collection of immune cell tracks from intravital 2-photon microscopy videos. Scientific Data. , (2018).
- Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 230-233 (2011).
- Beltman, J. B., Marée, A. F. M., De Boer, R. J. Analysing immune cell migration. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 789-798 (2009).
- Keller, H. U. Motility, cell shape, and locomotion of neutrophil granulocytes. Cell motility. 3 (1), 47-60 (1983).
- Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital Microscopy. Immunity. 21 (3), 315-329 (2004).
- Lambert Emo, K., et al. Live Imaging of Influenza Infection of the Trachea Reveals Dynamic Regulation of CD8+ T Cell Motility by Antigen. PLOS Pathogens. 12 (9), e1005881 (2016).
- Kjos, M., et al. Bright fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions. Journal of bacteriology. 197 (5), 807-818 (2015).
