Vi præsenterer her, en protokol for live-imaging af fluorescently mærket menneskelige endometrie fragmenter podet i mus. Metoden giver mulighed for at studere virkningerne af narkotika af valg på endometriotic læsion størrelse gennem overvågning og kvantificering af fluorescens udledes af fluorescerende reporter på realtid
Her, beskriver vi en protokol for gennemførelsen af en heterolog musemodel, hvor progressionen af endometriose kan vurderes i realtid via noninvasive overvågning af fluorescens udledes af implanterede ektopisk menneskelige endometriosevævet. Til dette formål fås biopsier af menneskelige endometriet fra donor kvinder løbende oocyt donation. Menneskelige endometrie fragmenter er kulturperler i overværelse af adenovirus manipuleret til at udtrykke cDNA for reporter fluorescerende protein mCherry. Efter visualisering, mærket væv med en optimal mængde af fluorescens efter infektion er efterfølgende valgt til implantation i modtagerens mus. En uge før implantering, recipient mus er oophorectomized, og estradiol pellets er placeret subkutant til at opretholde overlevelse og vækst af læsioner. På dagen for operationen er mus bedøvede og peritoneale hulrum adgang via en lille (1,5 cm) indsnit via linea-alba. Fluorescently mærket implantater er tweezed, kort indsmurt i lim og knyttet til laget peritoneal. Snit er syet, og dyr tilbage til at inddrive for et par dage. Fluorescens udledes af endometriotic implantater er normalt ikke-invasivt overvåget hver 3 dag for 4 uger med en in vivo billeddannelse system. Variationer i størrelsen af endometriotic implantater kan estimeres i realtid af kvantificering af mCherry signal og normalisering mod det oprindelige tidspunkt viser maksimal fluorescens intensitet.
Traditionelle prækliniske gnavere modeller af endometriose tillader ikke ikke-invasiv overvågning af læsion i realtid men snarere muliggøre evaluering af virkningerne af narkotika analyseres ved slutpunktet. Denne protokol tillader en at spore læsioner i realtid og er mere nyttigt at udforske den terapeutiske potentiale af narkotika i prækliniske modeller af endometriose. Den største begrænsning af modellen således genereret er non-invasiv overvågning ikke muligt over længere perioder på grund af det episomal udtryk for annonce-virus.
Endometriose er en kronisk gynækologisk lidelse initieret af implantation af funktionelle endometrium uden for livmoderhulen. Ektopiske læsioner vokse og inducerer inflammatoriske processer, der fører til kronisk bækken smerter og barnløshed1. Det anslås, at op til 10-15% af kvinder i den fødedygtige alder er påvirket af endometriosis2, og det er til stede i ca. 40 – 50% af infertile kvinder3. Nuværende farmakologiske behandlinger for endometriose er ude af stand til helt udrydde læsioner og ikke fri for bivirkninger4,5. Forskning for mere effektive terapier kræver af forfinelse af de eksisterende Dyremodeller for endometriose på en sådan måde, at menneskelige læsioner kan efterlignes korrekt, og virkningerne af forbindelser på læsion størrelse blandt andre kan vurderes nøje.
Primat modeller har været brugt til at efterligne endometriose ved at implantere ektopisk læsioner til histologisk identiske og på lignende steder som mennesker6,7,8; Men, etiske overvejelser og de høje økonomiske omkostninger relateret til forsøg med primater grænse deres brug9. Brugen af små dyr, især gnavere, til gennemførelsen af in vivo modeller af endometriose fortsat blive begunstiget, da det giver mulighed for undersøgelser med et større antal individer10,11. Endometriose kan være fremkaldt hos disse dyr ved hjælp af transplantation enten stykker af gnaver uterin horn (“homologe modeller”)12,13 eller menneskelige endometrie/endometriotic væv til ektopiske steder (heterolog modeller)14 . I modsætning til mennesker, gnavere kaste ikke deres endometriosevævet og dermed endometriose kan ikke udvikles spontant i disse arter. Homologe mus modeller af endometriose er blevet kritiseret, at implanteret ektopisk mus uterin væv afspejler derfor ikke Karakteristik af menneskelige endometriotic læsioner15.
Passende fysiologi af endometriose kan efterlignes i heterolog modeller af endometriose hvor frisk menneskelige endometrie fragmenter er implanteret i immundefekte dyr. I konventionelle heterolog modeller vurderes de terapeutiske virkninger af forbindelser af interesse almindeligvis ved slutpunktet ved vurdering af læsion størrelse med brug af calipre16. En indlysende begrænsning er, at som sådan slutpunkt dyremodeller ikke studerer implantation dynamics eller endometriotic læsion udvikling over tid. En yderligere begrænsning er, at brugen af calipre ikke tillader nøjagtige målinger af læsion størrelse. Faktisk, standard fejlmargen af calipre er i den samme række (f.eks. millimeter) som størrelsen af de læsioner, som implanteres i mus, dermed begrænser evne af disse værktøjer til at registrere faktiske variationer i størrelse.
For at overvinde sådanne begrænsninger, heri, beskriver vi generation af en heterolog musemodel af endometriose, hvor indopereret humant væv er manipuleret til at udtrykke en reporter m-Cherry fluorescerende proteiner. Påvisning af de fluorescerende signal med et passende billede system gør det muligt for ikke-invasiv overvågning af læsion status med samtidige kvantificering af sin størrelse i realtid. Således giver vores model klare fordele i forhold til konventionelle slutpunkt modeller, da det giver mulighed for real-time non-invasiv overvågning og muligheden for at udføre mere objektive og nøjagtig vurdering af variationer i læsion størrelse.
Protokollen heri detaljeret beskriver gennemførelsen af en dyremodel af endometriose, hvor arkitektur af implanterer læsioner arkitektur er bevaret mens samtidig giver mulighed for tidstro vurdering af fluorescens udledes af mCherry mærket endometriosevævet. I denne protokol beskriver vi brugen af en bestemt in vivo billedbehandlingssystem og tilhørende software til ikke-invasivt vurdere fluorescens udledes af mærket læsion. Hver bruger skal tilpasse protokollen afhængigt af specifikke imaging enhed og tilhørend…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af spanske Ministeriet for økonomi og konkurrenceevne gennem Miguel Servet Program [CP13/00077] cofounded af FEDER (Europæiske Regionaludviklingsfond) og tildelt til Dr. R. Gómez samt af Carlos III Institute of Health tilskud Dr R Gómez [PI14/00547 og PI17/02329] og Prof. A. Cano [PI12/02582].
Endosampler™ | Medgyn | 22720 | Cannula for sampling the uterine endometrium |
DMEM Medium | VWR | HYCLSH30285.FS | Medium |
Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | Adenoviral vector expressing mCherry |
PBS, 1X solution, sterile, pH 7,4 | VWR | E504-500ML | Buffer for washes |
Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/ 60 days | Innovative Research of America | SE-121 | Hormone pellets for rodents |
Vetbond™ Tissue Adhesive | 3M | 780-680 | Tissue adhesive |
Petri dishes in polystyrene crystal | Levantina | 367-P101VR20 | Petri dishes |
Penicillin-Streptomicin | Sigma | P4333-100ML | Antibiotics |
Syringes, medical 10 ml 0,5 ml | VWR | CODA626616 | Syringes |
Nitrile gloves, powder-free | VWR | 112-2754 | Gloves |
Soft swiss nude mice | Charles River | SNUSSFE05S | Mice for animal experiment |
Ivis Spectrum In vivo Imaging system | Perkin Elmer | 124262 | In vivo Monitoring equipment |
Living Image® (Ivis software) | Perkin Elmer | — | In vivo monitoring software |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | Enrichment serum |
96-well cell culture treated plates | Life technologies | 167008 | Culture plates |
Urine flasks | Summedical | 4004-248-001 | Flasks for washes |
Sterile surgical blades | (Aesculap Division) Sanycare | 1609022-0008 | Surgical blades |
Isovet 1000 mg/g | B-BRAUN | — | Isoflurane (Anesthetic) |
Buprex® 0.3 mg | Schering Plough S.A. | — | Buprenorphine (Analgesic solution) |
Injectable morphine solution 10 mg/mL | B BRAUN | — | Morphine (Analgesic solution) |
Monofyl® Absorbable Sutures | COVIDIEN | — | Sutures |
Desinclor chlorhexidine | Promedic SA | — | Antiseptic solution |
Microscopy DMi8 | Leica Mycrosystems | — | fluorescence microscope |
Hera Cell 150 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | Incubator |