Surveillance non invasive de la taille de la lésion dans un modèle murin hétérologues d’endométriose

Summary

Nous présentons ici un protocole pour vivre-imagerie des fragments de l’endomètre humains fluorescent étiquetés greffés chez des souris. La méthode permet d’étudier les effets des médicaments de choix sur la taille de la lésion endometriotic grâce à la surveillance et la quantification de la fluorescence émise par le journaliste fluorescent en temps réel

Abstract

Nous décrivons ici un protocole pour la mise en œuvre d’un modèle de souris hétérologues dans lequel la progression de l’endométriose peut être évaluée en temps réel grâce à une surveillance non invasive de la fluorescence émise par le tissu endométrial humain ectopique implanté. À cette fin, biopsie de l’endomètre humain proviennent de don d’ovocytes en cours de donateurs femmes. Des fragments de l’endomètre humains sont cultivées en présence de l’adénovirus machinés pour cDNA express pour le mCherry de protéine fluorescente de journaliste. Après visualisation, étiqueté tissus avec un taux optimal de fluorescence après infection sont par la suite choisi pour l’implantation chez les bénéficiaires. Une semaine avant la chirurgie d’implantation, souris bénéficiaires sont chez et pastilles d’estradiol sont placés par voie sous-cutanée pour soutenir la survie et la croissance des lésions. Le jour de la chirurgie souris sont cavité péritonéale et anesthésiée, accédée via une incision de petite taille (1,5 cm) de la linea alba-. Les implants fluorescent étiquetés sont épilés, brièvement trempés dans la colle et attachées à la couche péritonéale. Incisions sont suturées et animaux à gauche pour récupérer pendant quelques jours. Fluorescence émise par les implants endometriotic est habituellement non invasive surveillé tous les 3 jours pendant 4 semaines avec un système d’imagerie in vivo. Variations de la taille des implants endometriotic peuvent être estimées en temps réel par quantification du signal mCherry et normalisation contre le temps-point initial indiquant l’intensité de la fluorescence maximale.

Les rongeurs précliniques traditionnelles des modèles de l’endométriose ne permettent pas la surveillance non invasive de la lésion en temps réel mais plutôt permettent une évaluation des effets des médicaments testés à la fin. Ce protocole permet de suivre en temps réel des lésions et est plus utile d’explorer le potentiel thérapeutique des médicaments dans les modèles précliniques de l’endométriose. La principale limitation du modèle ainsi produite est que surveillance non invasive n’est pas possible sur de longues périodes de temps en raison de l’expression épisomiques d’Ad-virus.

Introduction

L’endométriose est une affection gynécologique chronique initiée par l’implantation de l’endomètre fonctionnel en dehors de la cavité utérine. Les lésions ectopiques croissent et induisent des processus inflammatoires, conduisant à la chronique pelvienne douleur et l’infertilité¹. On estime que vers le haut à 10 – 15 % des femmes en âge de procréer sont influencés par endometriosis2, et elle est présente dans environ 40 – 50 % des femmes infertiles³. Les traitements pharmacologiques actuels pour l’endométriose sont incapables d’éradiquer complètement les lésions et pas sans effets secondaires^4,5. La recherche des thérapies plus efficaces requiert du raffinement des modèles animaux existants de l’endométriose, de telle sorte que les lésions humaines peuvent être imitées de manière appropriée, et évaluer attentivement les effets des composés sur la taille de la lésion entre autres.

Modèles de primates ont été utilisés pour imiter l’endométriose par implantation ectopiques lésions histologiquement identiques et sur des sites similaires comme les humains^6,7,8; Toutefois, les préoccupations éthiques et le coût économique élevé liée à l’expérimentation avec les primates limite leur utilisation⁹. En conséquence, l’utilisation de petits animaux, surtout des rongeurs, pour la mise en œuvre de modèles in vivo de l’endométriose continue à être favorisée car elle permet des études avec un plus grand nombre de personnes^10,11. L’endométriose peut être induite chez ces animaux en transplantant des morceaux de rongeurs cornes utérines (modèles « homologues »)^12,13 ou tissu endométrial/endometriotic humain aux sites ectopiques (modèles hétérologues)¹⁴ . Contrairement aux humains, les rongeurs ne perdent pas leur tissu endométrial et ainsi l’endométriose ne peut pas être développé spontanément chez ces espèces. Par conséquent, homologue souris modèles de l’endométriose ont été critiquées en raison du fait qu’implanté des tissus utérins souris ectopique ne reflète pas les caractéristiques des lésions endometriotic humaines¹⁵.

Physiologie appropriée de l’endométriose peut être imitée dans les modèles hétérologues d’endométriose où des fragments de l’endomètre humains frais sont implantés chez des animaux immunodéficients. Les modèles conventionnels hétérologues, les effets thérapeutiques des composés d’intérêt sont généralement évalués à la fin par l’évaluation de la taille de la lésion à l’aide d’étriers¹⁶. Une limitation évidente est que, par conséquent, les modèles animaux de point de terminaison ne permettent pas étudier la dynamique de l’implantation ou le développement des lésions endometriotic au fil du temps. Une autre limite est que l’utilisation des étriers ne permet pas de mesures précises de la taille de la lésion. En effet, l’écart-type fourni par étriers est dans la même gamme (c.-à-d. millimètres) que la taille des lésions implantés chez des souris, limitant ainsi la capacité de ces outils pour détecter les variations réelles dans la taille.

Afin de surmonter ces limitations, dans les présentes, nous décrivons la génération d’un modèle de souris hétérologues d’endométriose dans lequel les tissus humains implantés sont conçu pour exprimer une protéine fluorescente de journaliste m-Cherry. Détection du signal fluorescent avec un système d’image appropriée permet une surveillance non invasive de l’état de la lésion avec quantification simultanée de sa taille en temps réel. Ainsi, notre modèle prévoit des avantages évidents par rapport aux modèles de point de terminaison conventionnelle car elle apporte la possibilité de surveillance non invasive en temps réel et la possibilité d’effectuer les plus objectives et une estimation précise des variations dans la taille de la lésion.

Protocol

L’utilisation d’échantillons de tissus humains a été approuvée par l’Institutional Review Board et le Comité d’éthique de l’Hospital Universitario La Fe. Consentement éclairé a fourni tous les patients. L’étude impliquant des animaux a été approuvé par le Comité institutionnel de protection Animal au Centro de Investigacion Principe Felipe de Valencia, et toutes les procédures ont été réalisées suivant les directives pour le soin et l’utilisation des mammifères auprès des instituts natio…

Representative Results

Nous décrivons ici le processus de création d’un modèle hétérologue d’endométriose dans lequel l’architecture des lésions est préservée par l’implantation de fluorescent étiquetés morceaux d’endomètre humain dans des souris immunodéficientes, permettant ainsi non invasif suivi de la progression de la lésion. Étiquetage des fragments de l’endomètre est réalisée par l’infection à adénovirus machinés pour express mCherry, une protéine à l’émission de f…

Discussion

Le protocole détaillé ci-après décrit la mise en œuvre d’un modèle animal de l’endométriose, dont l’architecture d’implantation architecture des lésions est préservée tout en permettant simultanément en temps réel de la fluorescence émise par mCherry marqués de tissu endométrial. Dans ce protocole, nous décrivons l’utilisation d’un appareil d’imagerie in vivo spécifique et des logiciels d’évaluation non invasive fluorescence émise par la lésion étiquetée. Chaque utilisateur doit adap…

Materials

Endosampler™	Medgyn	22720	Cannula for sampling the uterine endometrium
DMEM Medium	VWR	HYCLSH30285.FS	Medium
Ad-mCherry	Vector Biolabs	1767	Adenoviral vector expressing mCherry
PBS, 1X solution, sterile, pH 7,4	VWR	E504-500ML	Buffer for washes
Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/ 60 days	Innovative Research of America	SE-121	Hormone pellets for rodents
Vetbond™ Tissue Adhesive	3M	780-680	Tissue adhesive
Petri dishes in polystyrene crystal	Levantina	367-P101VR20	Petri dishes
Penicillin-Streptomicin	Sigma	P4333-100ML	Antibiotics
Syringes, medical 10 ml 0,5 ml	VWR	CODA626616	Syringes
Nitrile gloves, powder-free	VWR	112-2754	Gloves
Soft swiss nude mice	Charles River	SNUSSFE05S	Mice for animal experiment
Ivis Spectrum In vivo Imaging system	Perkin Elmer	124262	In vivo Monitoring equipment
Living Image® (Ivis software)	Perkin Elmer	—	In vivo monitoring software
Fetal Bovine Serum	Gibco	10082147	Enrichment serum
96-well cell culture treated plates	Life technologies	167008	Culture plates
Urine flasks	Summedical	4004-248-001	Flasks for washes
Sterile surgical blades	(Aesculap Division) Sanycare	1609022-0008	Surgical blades
Isovet 1000 mg/g	B-BRAUN	—	Isoflurane (Anesthetic)
Buprex® 0.3 mg	Schering Plough S.A.	—	Buprenorphine (Analgesic solution)
Injectable morphine solution 10 mg/mL	B BRAUN	—	Morphine (Analgesic solution)
Monofyl® Absorbable Sutures	COVIDIEN	—	Sutures
Desinclor chlorhexidine	Promedic SA	—	Antiseptic solution
Microscopy DMi8	Leica Mycrosystems	—	fluorescence microscope
Hera Cell 150 Incubator	Thermo Scientific	51026282	Incubator