성인 표 피를 통해 초파리 다리 모터 신경 축 삭을 시각화
Summary
여기는 고정, 설치, 영상, 및 후 이미징 단계 초파리 의 성인 다리에 형광 단백질 axonal 대상으로 시각화 하는 프로토콜에 설명 합니다.
Abstract
대부분 신경 사양에 대 한 작업의 유전자와 순수 세공 모델 C에서 실시 되었습니다. 선 충, 초파리 애벌레 및 물고기, 모든 운동의 그들의 기본 모드 (예: 크롤링 또는 수영) undulatory 운동에 참여. 그러나, 보다 정교한 개별 모터 신경 (미네소타) 규격의 이해-이상 질병 치료를 알리는 측면에서-더 나은 모델의 복잡 한 돌출부 기반 운동 체계는 동등 하 게 세공 시스템 요구 척추 동물입니다. 걸어 담당 성인 초파리 운전 시스템 모두 충족 이러한 기준의 쉽게, 이후이 모델에서 쉽게 고유 다리 MNs (다리 당 약 50 MNs) 작은 수의 규격을 연구 수 둘 다 광대 한 사용 강력한 유전자 도구, 및 돌출부 기반 운동 체계의 생리 적 맥락에서 배열입니다. 여기 우리는 성인 비행에 다리 근육 신경 분포를 시각화 하는 프로토콜을 설명 합니다.
Introduction
척 추가 있는 사지 처럼 초파리 성인 다리 세그먼트로 구성 됩니다. 각 비행 다리는 각각의 구성 하는 여러 근육 섬유1,214 근육을 포함 되어 있습니다. 성인 다리 MNs의 셀 시체 (prothoracic) T1, t 2 (mesothoracic), 및 복 부 신경 코드 (VNC), 척추 척수 (그림 1)에 유사한 구조의 각 측에 T3 (metathoracic) 중추에 있습니다. 어떤 대상 근육은 동측 다리 (고관절, trochanter, 대 퇴 골, 경골)의 4 개의 세그먼트에서 (그림 1)3각 중추에 약 50 MNs가 있다. 중요 한 것은, 각 개별 성인 다리 미네소타 동물3,4사이 진부 매우 독특한 형태학 상 id를 있다. 이러한 독특한 MNs 라는 neuroblasts (NBs) 다리 MNs 애벌레 단계3,4생산 11 줄기 세포에서 파생 됩니다. 모든 애벌레 단계의 끝에 미 숙 postmitotic MNs 취득 그들의 특정 수지상 아 버 및 axonal 터미널 대상 그들의 독특한 형태3,4를 정의 하는 변 태 중 분화. 이전 녹음 방송 요인 (TFs)의 조합 코드 각 초파리 성인 다리 미네소타5의 독특한 형태를 지정 하는 가설 테스트. 모델, 우리 혈통 B 11 주의 계보는 MNs에서 7을 생산 하 고 조합 코드 postmitotic 성인 다리 MNs에에서 표현 하는 TFs의 그들의 개별 형태학 지시 증명 중 하나를 사용 합니다. MNs의 TF 코드 reprograming 여 우리 미네소타 형태학 예측 가능한 방식으로 전환할 수 있다. 우리는 이러한 TFs 전화: mTFs (형태학 TFs)5.
성인 MNs의 형태소 분석의 가장 어려운 부분 중 하나는 높은 해상도 자동 형광 표 피를 통해 축 삭을 시각화입니다. 우리는 일반적으로 DVglut Gal4같은 이진 식 시스템과 MNs에 표현 되는 막 태그 GFP와 축 삭 라벨 /UAS-mCD8::GFP 또는 DVglut-QF / QUAS mCD8::GFP, DVglut 는에 표현 하는 강한 드라이버 motoneurons6. Repressible 마커 (MARCM)7,8, cis-MARCM 또는 MARCMbow5모자이크 분석 등 다른 클론 기술로 이러한 도구를 결합 하 여 MNs phenotypic 분석의 모집단 GFP 식이 제한할 수 있습니다. 축 삭 쉽게. 우리는 프로토콜 성인 다리의 내부 구조 (1) 고정 등 성인 초파리 다리에 본질적인 특정 문제를 해결 하 여 이미징 및 후속 3D 재구성 그대로 다리 미네소타 axonal 형태를 유지 하기 위해 생성 된 축 삭 형태학, 형광 식 생과 다리 근육에 영향을 주지 않고 전체 구조는 coverslip 아래와 표 피를 처리 하는 이미지, 그리고 (3) 이미지에 대 한 적절 한 방향으로 유지 하기 위해 다리의 (2) 장착 배경으로 axonal 형광 신호입니다. 이 프로토콜 미네소타 axons에서 형광 식의 검출에 대 한 자세한 되었습니다 동안 시각화 절지동물의 다리 neuromusculature의 다른 구성 요소에 적용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
표 피 성인 초파리와 다른 절지동물의 많은 어두운 안료를 포함 하는 그들의 신체 내부 구조를 보기 위한 중요 한 장애 이다. 또한, 그것은 강력 하 게 고정 하 여 악화 시킨 자동 형광입니다. 이 두 기능은 매우 형광 염료 또는 외 골격을 가진 동물의 체 내 분자의 관찰에 대 한 문제가 있다.
우리가 설명 하 고 우리가 일상적으로 실험실에서 사용 하는 절차는 축 삭 궤도의 고 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리 감사 로버트 Renard 비행 음식 매체를 준비. 이 작품은 NIH 그랜트 NS070644 R.S.M.에 의해 지원 되 고 J.E.에 ALS 협회 (#256), FRM (#AJE20170537445)와 ATIP 미래 프로그램에서 자금
Materials
| Ethanol absolute | Fisher | E/6550DF/17 | Absolute analytical reagent grade |
| nonionic surfactant detergent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100, for molecular biology |
| Fine forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | Jewelers forceps, Dumont No. 5 |
| Glass multi-well plate | Electron Microscopy Sciences | 71563-01 | 9 cavity Pyrex, 100×85 mm |
| PFA | Thermofisher | 28908 | Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP 229-1 | Glycerol (Molecular Biology) |
| Spacers | Sun Jin Lab Co | IS006 | iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep |
| Square 22×22 mm coverslips | Fisher Scientific | FIS#12-541-B | No.1.5 -0.16 to 0.19mm thick |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Vectashield Antifade Mounting Medium |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM780; objective used LD LCI Plan-Apochromat 25x/0,8 Imm Korr DIC M27 (oil/ silicon/glycerol/water immersion) (420852-9871-000) |
|
| imaging software | Carl Zeiss | ZEN 2011 | |
| 3D-Image software | ThermoFisher Scientific | Amira 6.4 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | ImageJ/FIJI |
Referências
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