성인 Zebrafish의 구강 삽 관 법: 생리 활성 화합물의 장의 이해를 평가 하기 위한 모델
Summary
생물 학적;와 intubating 성인 zebrafish를 프로토콜에 설명 합니다. 그리고 해 부 cytometry, confocal 현미경 검사 법 및 정량에 대 한 소장을 준비 합니다. 이 메서드는 관리를 장의 글귀와 로컬 면역 자극을 갖는 생리 활성 화합물의 수 있습니다. 그것은 구두 prophylactics의 장 역학 테스트 관련이 있습니다.
Abstract
대부분 병원 체 유기 체 그들의 점 막을 통해 침입 한다. 이것은 생선에 특히 사실 그들은 지속적으로 미생물이 풍부한 물 환경에 노출 되는. Immunostimulants 또는 백신, 전염 성 질병에 대 한 면역 시스템을 활성화 하는 구두 납품을 위한 효과적인 방법을 개발 하는 것이 매우 바람직하다입니다. 예방 도구를 고안, 좋은 실험 모델의 성능을 테스트 필요 합니다. 여기, 우리는 성인 zebrafish의 구강 삽 관 법에 대 한 방법 및 해 부 cytometry, confocal 현미경 검사 법 및 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 분석에 대 한 소장을 준비 하는 절차의 집합을 보여줍니다. 이 프로토콜, 우리가 정확 하 게 동물을 해치지 않고 약 1 g을 간단 하 고 신속 하 게, 무게 물고기 50 µ L까지 볼륨을 관리할 수 있습니다. 이 방법은 삽 관 법 후 장 점 막 및 로컬 사이트에 같은 생물 의약품의 immunomodulatory 용량 붙일 이라는 화합물의 직접 vivo에서 이해를 탐험 수 있습니다. 장 조직의 confocal 현미경 검사 법, 정량, 조직학, cytometry 등 다운스트림 메서드를 결합해 서, 우리는 immunostimulants 또는 예방 접종 수 있는 방법을 장 점 막 방 벽을 교차, 통과 lamina propria 이해할 수 있다 고 장내 점 막 면역 시스템에 효과 발휘 하는 근육에 도달 합니다. 모델 후보 구두 prophylactics 및 전달 시스템 또는 로컬 효과 있는 구두 관리 생리 활성 화합물의 테스트 사용 될 수 있습니다.
Introduction
이 문서의 목표는 깊이에 유용한 연결 된 다운스트림 절차 함께 zebrafish의 구강 삽 관 법에 대 한 간단한 방법 설명. 제 브라를 사용 하 여 구강 삽 관 법의 전염병 역학, 구강 백신/immunostimulant, 마약/나노 통풍 관 및 효능, 장내 점 막 면역 연구에 실용적인 모델 되고있다. 예를 들어 zebrafish 구강 삽 관 법 진 균 marinum 고 진 균 peregrinum 감염1의 연구에 사용 되었습니다. Lovmo 외. 또한 나노 입자 및 M. marinum 는 위장 지역 성인 zebrafish2를 제공을 성공적으로이 모델을 사용. 첸 외. 마약, 나노 입자에 의해 캡슐화 보여 zebrafish 구강 삽 관 법을 사용 하는 또한 때 관리를 통해 위장 관의 혈액 두뇌 방 벽3에서 수송 되었다. 이 저자 수행 Collymore 그 외 여러분 에 의해 설명 하는 gauvage 방법에 따라 삽 관 법 몇 가지 수정 4 . 그러나, 그들은 구두 삽 관 법 절차를 설명 하는 매우 상세한 프로토콜을 제공 하지 않았다. 여기, 우리 Collymore 외 에 성인 zebrafish의 구강 삽 관 법에 대 한 방법 제시 4 우리는 더 cytometry, confocal 현미경 검사 법 및 정량 소장 관련 다운스트림 분석에 대 한 준비 포함.
소장 및 특히 그것의 점 막 감염에 대 한 방어의 첫 번째 라인 및 양분 통풍 관5의 주 사이트입니다. 상피 세포와 점 막 장벽 내에서 항 원 제시 세포 위험 신호 인식 때 즉시 타고 난 면역 반응은 트리거됩니다. 다음으로, 매우 구체적인 적합 한 면역 반응 T와 B 림프 톨6,7으로 설정 됩니다. 구강 백신의 개발 백신에 현재 초점 지역 이다. 이러한 백신 노출된 사이트 점 막 관련 림프 조직 (맥 아)8,9에 면역 세포의 특정 응답 때문에 유기 체를 보호 하기 위해 효과적인 도구 것입니다. 양식, 점 막 백신 주사 백신에 비해 분명 장점이 있다. 그들은 보다 적게 노동 집약 대량 예방 접종에 대 한 실용적, 물고기, 보다 적게 스트레스가 많은 있으며 젊은 물고기를 관리할 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 점 막 백신 후보자 없이 구강 환경에서 변성 되 고 두 번째 직감 세그먼트를 도달 해야 한다. 그들은 또한 항 원 제시 세포 (Apc) 로컬 및/또는 조직의 응답10유도 하에 액세스 점 막 방 벽을 교차 해야 합니다. 따라서, 후보 구두 항 원 및 그들의 배달 시스템을 함으로써 점 막 통풍 관의 테스트, 갖는, 면역 반응 뿐만 아니라에 필수적입니다 구강 백신의 개발.
생물 의학 맥락에서 후 구강 삽 관 법은 성장 관심사의 이다 화합물의 생물 학적 효과 테스트 하는 모델을 개발. 내장의 해 부 및 생리 기능의 많은 포유류와 나폴레옹 물고기11bilaterian 계보 사이 보존 됩니다. 다운스트림 분석에 연결 하는이 구두 삽 관 법 모델 생물 의약품에 대 한 테스트 땅 뿐 아니라 인간의 생물학으로 통찰력을 제공 하는 도구 일 수 있다 또는 다른 비보에화합물.
구강 삽 관 법 프로토콜 성공적으로 물고기는 높은 생존 율과 무게 1 g, 단백질 나노 입자 현 탁 액의 최대 50 µ L를 관리 예를 들어, 하나의 연산자에 의해 수행할 수 있습니다. 절차는 간단 설정 하 고 빠른; 1 시간에 30 물고기를 intubated 수 있습니다. 내장 준비를 위한 프로토콜은 후속 분석을 위한 질 세포 및 조직 샘플을 제공 하는 열쇠입니다. 다운스트림 결과의 예는 장 통풍 관에 관련 된 데이터를 취득 및 정량에 대 한 품질 RNA 격리 프로토콜의 유용성을 표시 하는 주어진 다. 프로토콜 내장에서 구두 prophylactics의 역학 또는 다른 화합물을 테스트 하는 적합 한 모델을 필요 들을 잘 사용 될 것 이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 Collymore 그 외 여러분 에 의해 구강 삽 관 법에 대 한 앞에서 설명한 방법의 개선 4 우리의 프로토콜 구강 삽 관 법 방법 자세히 설명 하 고 다운스트림 분석에 대 한 내장의 준비를 포함 한다. 우리의 방법은 사업자 사이 많은 변화 없이 빠르게, 전체 프로토콜을 수행 하는 한 사람을 허용 하는 물고기 조작 속도를 향상 시킵니다. 우리의 이전 프로토콜의 주요 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 유럽 위원회와 AGAUR 자금 (AGL2015-65129-R MINECO/페더 및 2014SGR-345 AGAUR) NR 과학, 스페인 정부에서 교부 금에 의해 지원 되었다. RT는 AGAUR (스페인), JJ에서에서 전 박사 장학금 중국 장학금 위원회 (중국)에서 박사 학위 장학금에 의해 지원 되었다와 NR 라몬 y Cajal 프로그램 (RYC-2010-06210, 2010, MINECO)에 의해 지원 됩니다 보유 하고있다. 우리는 단백질 생산, “룸 드 Microscopia”에서 명 Barba 전문가 조언에 감사 박사 Torrealba와 Universitat Autònoma 드 바르셀로나 유용한 기술 지원의 “룸 드 Citometria”에서 닥터 엠 코스타.
Materials
| Silicon tube | Dow Corning | 508-001 | 0.30 mm inner diameter and 0.64 mm outer diameter |
| Luer lock needle | Hamilton | 7750-22 | 31 G, Kel-F Hub |
| Luer lock syringe | Hamilton | 81020/01 | 100 μL, Kel-F Hub |
| Filtered pipette tip | Nerbe Plus | 07-613-8300 | 10 μL |
| MS-222 | Sigma Aldrich | E10521 | powder |
| 10x PBS | Sigma Aldrich | P5493 | |
| Filter paper | Filter-Lab | RM14034252 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| DMEM | Gibco | 31966 | Dulbecco's modified eagle medium |
| Penicillin and streptomycin | Gibco | 15240 | |
| Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| CellTrics filters | Sysmex Partec | 04-004-2326 (Wolflabs) | 30 µm mesh size filters with 2 mL reservoir |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | SAKURA | 4583 | |
| Plastic molds for cryosections | SAKURA | 4557 | Disposable Vinyl molds. 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| Slide | Thermo Scientific | 10149870 | SuperFrost Plus slide |
| Cover glasses | Labbox | COVN-024-200 | 24´24 mm |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Atto-488 NHS ester | Sigma-Aldrich | 41698 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | Promega | AS1340 | |
| 1-Thioglycerol/Homogenization solution | Promega | Inside of Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | adding 20 μl 1-Thioglycerol to 1 ml homogenization solution (2%) |
| vertical laboratory rotator | Suministros Grupo Esper | 10000-01062 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Homogenizer | KINEMATICA | Polytron PT1600E | |
| Flow cytometer | Becton Dickinson | FACS Canto | |
| 5 mL round bottom tube | Falcon | 352058 | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 | |
| Fume Hood | Kottermann | 2-447 BST | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent | G2939A | RNA bioanalyzer |
| Maxwell Instrument | Promega | AS4500 | |
| iScript cDNA synthesis kit | Bio-rad | 1708891 | |
| CFX384 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855485 | |
| iTaq universal SYBR Green Supermix kit | Bio-rad | 172-5120 | |
| Water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Cryogenic vial | Thermo Fisher Scientific | 375418 | CryoTube vial |
| Mounting medium | Sigma-Aldrich | F6057 | Fluoroshield with DAPI |
Referências
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