Rica em cisteína peptídeos dobram em distintas estruturas tridimensionais dependendo sua conectividade de dissulfeto. Síntese alvo de isómeros de bissulfeto individual é necessária quando oxidação de reserva não implica que a conectividade de bissulfeto desejado. O protocolo lida com a síntese seletiva de peptídeos 3-bissulfeto-ligado e sua análise estrutural usando estudos NMR e MS/MS.
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Artigo de método
Síntese e determinação da estrutura de µ-conotoxina PIIIA isômeros com bissulfeto diferentes conetividades
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Neste artigo
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Resumo
Resumo
Peptídeos com um elevado número de cisteínas geralmente são influenciados em relação a estrutura tridimensional por sua conectividade de bissulfeto. Assim, é altamente importante para evitar a formação de ligação dissulfeto indesejáveis durante a síntese do peptide, porque pode resultar em uma estrutura completamente diferente do peptide e consequentemente alterado Bioatividade. No entanto, a correta formação de múltiplas ligações de bissulfeto em um peptídeo é difícil de obter por meio de métodos Self dobramento padrão tais como protocolos de oxidação do amortecedor convencional, porque vários conetividades dissulfeto podem ser formadas. Este protocolo representa uma estratégia avançada necessária para a síntese de alvo de múltiplas em ponte dissulfeto de peptídeos que não pode ser sintetizado através da oxidação de reserva na alta qualidade e quantidade. O estudo demonstra a aplicação de uma estratégia de grupo protegendo distintas para a síntese de todos os isómeros possíveis do peptide 3-bissulfeto-ligado de µ-conotoxina PIIIA de forma orientada. Os peptídeos são preparados pela síntese de peptídeo de fase sólida baseada em Fmoc usando uma estratégia de grupo protegendo para formação de ligação dissulfeto definidos. Os respectivos pares de cisteínas estão protegidos com trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm) e tert-butílico (tBu) protegendo grupos para certificar-se que, durante cada etapa de oxidação somente as necessárias cisteínas são deprotected e ligadas. Além da síntese de alvo, uma combinação de vários métodos analíticos é usada para esclarecer o correto dobramento e geração das estruturas de peptídeo desejado. A comparação dos diferentes isômeros 3-bissulfeto-ligado indica a importância da determinação precisa e conhecimento da conectividade bissulfeto para o cálculo da estrutura tridimensional e a interpretação do biológico atividade dos isômeros do peptide. A caracterização analítica inclui a elucidação de ligação dissulfeto exata através de análise de espectrometria de massa (MS/MS) em tandem, que é realizado com derivados alquilados e parcialmente reduzidos do isômero intacta peptídeo produzido por um protocolo adaptado. Além disso, as estruturas do peptide são determinadas usando 2D da ressonância magnética nuclear (NMR) experiências e os conhecimentos resultantes da análise de MS/MS.
Introdução
O uso de peptídeos bioativos em pesquisa farmacêutica e desenvolvimento é altamente reconhecido, porque eles representam compostos potentes e altamente seletivos para alvos biológicos específicos1. Para sua bioatividade, no entanto, a estrutura tridimensional é de grande importância a fim de realizar a relação estrutura-atividade estudos2,3,de4. Além da sequência de aminoácidos primários que influencia a conformação geral, ligações de bissulfeto significativamente estabilizem a estrutura de peptídeos ricos em cisteína5. Vários p....
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Protocolo
Nota: Todos os aminoácidos utilizados neste documento foram na L-configuração. As abreviaturas de aminoácidos e aminoácidos derivados foram utilizadas de acordo com as recomendações do Comité de nomenclatura de IUB e a Comissão conjunta de IUPAC-IUB na nomenclatura Biochemical.
1. síntese do Peptide solid-Phase (SPPS)
Nota: Efectuar a síntese com um sintetizador de peptídeo de fase sólida. Realize a síntese dos precursores do peptide linear da sequência geral ZRLCCGFOKSCRSRQCKOHRCC-NH2 usando um protocolo padrão para a química de 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc). Aplicar os seguintes aminoácidos prote....
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Resultados
15 diferentes isômeros em ponte dissulfeto de PIIIA o µ-conotoxina são sintetizados e caracterizados em detalhes (Figura 1). Ligações dissulfureto são identificadas pela redução parcial e posterior análise de MS/MS (Figura 2). NMR análise dos diferentes isômeros é executada (Figura 3) para revelar as estruturas individuais do peptide. Notavelmente, uma combinação de análise NMR, fragmentação de MS/MS.......
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Discussão
O método aqui descrito para a síntese de peptídeos ricos em cisteína como µ-PIIIA representa uma possibilidade de produzir seletivamente dissulfeto-ligado de isômeros da mesma sequência de aminoácidos. Portanto, estabeleceu métodos como sólido baseado em Fmoc fase de síntese do peptide18 e uma estratégia de grupo protegendo definida para a formação de regioselective de ligações de bissulfeto foram usados16. A síntese do peptide de fase sólida pode produzir sequências de ami.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer a r. Resemann, F. J. Mayer e D. Suckau da Bruker Daltonics GmbH Bremen; D. Tietze, r. r. Tietze, Schmidts V. e C. Thiele da Universidade de tecnologia de Darmstadt; O. Ohlenschläger o Jena FLI, M. Engeser, da Universidade de Bona; K. Kramer, r. Harzen e H. Nakagami, do Instituto Max Planck para pesquisa de reprodução da planta, Colónia; Susanne Neupert do Instituto de Zoologia, Colónia; e as instalações de espectroscopia de ressonância magnética Biomolecular da Universidade de Frankfurt para técnico suporte, módulos, de formação e acesso aos instrumentos. Apoio financeiro da Universidade de Bonn ao D.I. com gratidão é reconhecido.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| PS PEG2000 Fmoc Resina de Rinque-amida | Varian, Inc. | PL3867-3764 | AmphiSpheres 40 RAM |
| Pyr (Boc) | Bachem | A-3850 | |
| Arg (Pbf) | Iris Biotech | FSC1010 | |
| Asn (Trt) | Bachem | B-1785 | |
| Asp (tBu) | Iris Biotech | FSP1020 | |
| Hyp (tBu) | Iris Biotech | FAA1627 | |
| Lys (Boc) | Bachem | B-1080 | |
| Ser(tBu) | Iris Biotech | FSC1190 | |
| Gln(Trt) | Iris Biotech | FSC1043 | |
| Glu(tBu) | Iris Biotech | FSP1045 | |
| Trp(Boc) | Iris Biotech | FSC1225 | |
| Tyr(tBu) | Sigma Aldrich | 47623 | |
| Thr(tBu) | Iris Biotech | FSP1210 | |
| His(Trt) | Iris Biotech | FDP1200 | |
| 2-(1H-Benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurôniohexafluorfosfato | Sigma Aldrich | 8510060 | Inflamável |
| DMF Fisher Scientific | D119 | Inflamável, Tóxico | |
| DCM | Fisher Scientific | D37 | Cancerígeno |
| Piperidina | Alfa Aesar | A12442 | Inflamável, Tóxico, Corrosivo |
| N-Metil-Morpholina | Sigma Aldrich | 224286 | |
| Cys (Acm) | Iris Biotech | FAA1506 | |
| Cys (Trt) | Bachem | E-2495 | |
| Cys (tBu) | Bachem | B-1220 | |
| ácido trifluoruacético | Sigma Aldrich | 74564 | Tóxico, |
| fenol | Merck | 1002060 | Tóxico |
| tioanisol | Alfa Aesar | A14846 | |
| etanoditaiol | Fluka Analytical | 2390 | |
| éter dietílico | VWR | 100.921 | |
| Terc-butanol | Alfa Aesar | L12338 | |
| Acetonitrilo | Fisher Scientific | A998 | Água inflamável |
| Fisher Scientific | W5 | ||
| isopropanol | VWR | ACRO42383 | Hidróxido |
| de sódio | AppliChem | A6579,1000 | |
| Iodoacetamida | Sigma Aldrich | I6125 | |
| Iodo | Sigma Aldrich | I0385 | |
| Ácido clorídrico | Merck | 110165 | |
| Ácido ascórbico | Sigma Aldrich | A4403 | |
| difenilsulfóxido Sigma | Aldrich | P35405 | |
| anisol | Sigma Aldrich | 96109 | |
| Triclorometilsilano | Sigma Aldrich | M85301 | |
| Tampão de diluição de amostra | Laborservice Onken | ||
| dihidrogenofosfato de sódio | Sigma Aldrich | 106370 | |
| hidrogenofosfato dissódico | Sigma Aldrich | 795410 | |
| (2-carboxietil)cloridrato de fosfina | Sigma Aldrich | C4706 | |
| ácido cítrico | Sigma Aldrich | 251275 | |
| citrato de sódio di-hidratado | Sigma Aldrich | W302600 | |
| tris-acetato | Carl Roth, | 7125 | |
| Ácido etilenodiaminotetracético | Sigma Aldrich | E26282 | |
| padrão de calibração de peptídeos II | Bruker Daltonics GmbH | 8222570 | |
| Nome do Equipamento | Empresa | ||
| sintetizador de peptídeos em fase sólida | Intavis Bioanalytical Instruments AG | EPS 221 | |
| liofilizador | Martin Christ GmbH | Alpha 1-2 Ldplus | |
| semipreparative HPLC | Jasco | system PV-987 | |
| Eurospher 100 C18 coluna (RP, 5 µ m tamanho de partícula, 100 & tamanho dos poros, 250 x 32 mm) | Purificação Knauer | 25QE181E2J | do peptídeo linear |
| Vydac 218TP1022 coluna (RP C18, 10 µ m tamanho de partícula, 300 & tamanho dos poros, 250 x 22 mm) | Hichrom-VWR | HICH218TP1022 | purificação do peptídeo oxidado |
| analítico HPLC | Sistema Shimadzu | LC-20AD | |
| Vydac 218TP54 coluna (C18 RP, 5 µ m tamanho de partícula, 300 & tamanho dos poros, 250 x 4,6 mm) | de | coluna analítica | Hichrom-VWR |
| HICH218TP54 (MTP 384) | Bruker Daltonics GmbH | NC0910436 | preparação MALDI |
| Filtro de concentração C18 (ZipTip) | Merck KGaA | ZTC18S096 | preparação para MALDI |
| Espectrômetro de massa MALDI | Bruker Daltonics GmbH | ultraflex III TOF/TOF | |
| analisador de aminoácidos | Eppendorf-Biotronik GmbH | do sistema | |
| Bruker Avance III | Bruker Daltonics GmbH | Bruker Avance III Programa de computador de 600 MHz | |
| para visualização molecular | YASARA Biosciences GmbH | Estruturas Yasara | Cálculo da estrutura de RMN |
| programa de computador para avaliação de dados MALDI | Bruker Daltonics GmbH | flexAnalysis, BioTools | MS/MS |
| misturador de vórtice analógico | VWR | VM 3000 | |
| Microcentrífuga | Eppendorf | 5410 | |
| Centrífuga | Hettich | EBA 20 | |
| Concentrador rotativo a vácuo | Christ | 2-18 Cdplus | |
| Balança Analítica | A& D Instrumentos | GR-202-EC |
Referências
- Fosgerau, K., Hoffmann, T. Peptide therapeutics: Current status and future directions. Drug Discovery Today. 20 (1), 122-128 (2015).
- Gongora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics. Chemical Reviews. <....
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Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum: Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities
Posted by JoVE Editors on 11/01/2018. Citeable Link.
An erratum was issued for: Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities. The Protocol and Materials sections were updated.
Step 1.1.3 in the Protocol section was updated from:
Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 2.4 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.
to:
Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 0.6 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.
Step 1.2 in the Protocol section was updated from:
NOTE: The protocol applies to 100 mg of resin (loading: 0.28 mmol/g) added to one reaction column for 28 μmol scale.
to:
NOTE: The standardized protocol usually applies to 100 mg of resin (loading: 0.53 mmol/g) added to one reaction column for 53 μmol scale leading to the following equivalents: 5 eq. HBTU, 10 eq. NMM, 5 eq. amino acid. In case of PIIIA, however, a loading of 0.28 mmol/g (28 µmol scale) is used, which results in the specified higher equivalents.
Step 1.2.3.1 in the Protocol section was updated from:
HBTU (450 µL; 0.6 M in DMF; 270 µmol; 9.6 eq.), NMM (125 µL; 50% in DMF; 568 µmol; 20 eq.), Fmoc-amino acid (420 µL; 2.4 M in DMF; 1.01 mmol; 36 eq.).
to:
HBTU (415 µL; 0.6 M in DMF; 249 µmol; 9 eq.), NMM (112 µL; 50% in DMF; 510 µmol; 18 eq.), Fmoc-amino acid (420 µL; 0.6 M in DMF; 252 µmol; 9 eq.).
The first item in the Materials table was updated from:
| Fmoc Rink amide resin | Novabiochem | 855001 |
to:
| PS PEG2000 Fmoc Rink-amide Resin | Varian, Inc. | PL3867-3764 | AmphiSpheres 40 RAM |
