कम सीरम शर्तों के तहत कार्डियक जनक कोशिकाओं में Endothelial विभेद की प्रेरण
Summary
इस प्रोटोकॉल कार्डियक जनक कोशिकाओं के लिए एक endothelial भेदभाव तकनीक का वर्णन । यह विशेष रूप से कैसे सीरम एकाग्रता और कोशिका बोने घनत्व endothelial भेदभाव क्षमता को प्रभावित पर केंद्रित है ।
Abstract
कार्डियक जनक कोशिकाओं (CPCs) चोट के बाद कार्डियक पुनर्जनन के लिए चिकित्सीय क्षमता हो सकती है । वयस्क स्तनधारी दिल में, आंतरिक CPCs अत्यंत दुर्लभ हैं, लेकिन विस्तारित CPCs सेल थेरेपी के लिए उपयोगी हो सकता है । उनके उपयोग के लिए एक शर्त के लिए विभिंन हृदय में परिभाषित और कुशल प्रोटोकॉल का उपयोग कर वंश में एक नियंत्रित तरीके से अंतर करने की क्षमता है । इसके अलावा, पर इन विट्रो विस्तार में , CPCs रोगियों या पूर्व नैदानिक रोग मॉडल से पृथक रोग तंत्र की जांच के लिए उपयोगी अनुसंधान उपकरण की पेशकश कर सकते हैं ।
वर्तमान अध्ययन CPCs की पहचान करने के लिए विभिन्न मार्कर का उपयोग करें । हालांकि, उन सभी को मानव में व्यक्त नहीं कर रहे हैं, जो कुछ नैदानिक अध्ययन के शोधों के प्रभाव को सीमित करता है । भेदभाव प्रोटोकॉल है कि चाहे अलगाव तकनीक और मार्कर अभिव्यक्ति के लागू कर रहे है मानकीकृत विस्तार और सेल थेरेपी प्रयोजन के लिए CPCs के भड़काने के लिए अनुमति देगा । यहां हम वर्णन है कि एक कम भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) एकाग्रता और कम सेल घनत्व की स्थिति के तहत CPCs की भड़काना CPCs के endothelial भेदभाव की सुविधा । माउस और चूहे CPCs के दो विभिंन उपआबादी का प्रयोग, हम बताते है कि laminin एक और निंनलिखित प्रोटोकॉल के तहत इस प्रयोजन के लिए fibronectin से उपयुक्त सब्सट्रेट: संवर्धन के बाद 2-3 दिनों के लिए पूरक शामिल है कि multipotency बनाए रखने और ३.५% FBS के साथ, CPCs पर laminin पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं < 60% संगम और में कल्चरल पूरक-FBS के कम सांद्रता के साथ नि: शुल्क मध्यम (०.१%) endothelial विभेदक माध्यम में भिंनता से पहले 20-24 घंटे के लिए । क्योंकि CPCs एक विषम आबादी हैं, सीरम सांद्रता और गर्मी बार संबंधित सीपीसी उपजनसंख्या के गुणों के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है । इस पर विचार, तकनीक CPCs के अंय प्रकार के रूप में अच्छी तरह से लागू किया जा सकता है और एक उपयोगी विधि की क्षमता और भेदभाव के तंत्र की जांच और कैसे वे रोग से प्रभावित जब संबंधित रोग मॉडल से अलग CPCs का उपयोग कर रहे है प्रदान करता है ।
Introduction
हाल के अध्ययनों वयस्क स्तनधारी दिल1,2,3में निवासी कार्डिएक जनक कोशिकाओं (CPCs) के अस्तित्व का समर्थन है, और CPCs कार्डियक चोट4के बाद सेल थेरेपी के लिए एक उपयोगी स्रोत हो सकता है, 5. इसके अलावा, विस्तारित CPCs दवा स्क्रीनिंग के लिए एक उपयोगी मॉडल प्रदान कर सकते है और रोग तंत्र की जांच जब दुर्लभ cardiomyopathies, या संबंधित रोग मॉडल6,7से रोगियों से अलग ।
CPCs वयस्क दिल से अलग स्टेम/जनक सेल विशेषताओं1,2,3,8 के रूप में वे multipotent, clonogenic हैं, और स्वयं के नवीकरण के लिए क्षमता है । हालांकि, वहां कई अलग है (उप) CPCs की आबादी अलग सतह मार्कर प्रोफाइल प्रदर्शन, सहित, उदाहरण के लिए, सी किट, Sca-1, और दूसरों, या अलग अलगाव तकनीकों (तालिका 1) द्वारा प्राप्त की । कई संस्कृति और भेदभाव प्रोटोकॉल स्थापित किया गया है1,2,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18. इन प्रोटोकॉल ज्यादातर वृद्धि कारक और सीरम सामग्री है, जो संवर्धन के प्रयोजन के अनुसार समायोजित कर रहे है और जो परिणाम और परिणामों में अंतर करने के लिए नेतृत्व कर सकते है के संबंध में भिंनता, भेदभाव दक्षता सहित ।
मार्कर-आधारित आइसोलेशन तकनीक:
CPCs एक विशिष्ट सतह मार्कर अभिव्यक्ति के आधार पर अलग किया जा सकता1,2,8,9,10,11,12,13 ,१४,१५,१६,१७,१८. पिछले अध्ययनों से सुझाव है कि सी-किट और Sca-1 निवासी CPCs1,11,14,19,20को अलग करने के लिए सबसे अच्छा मार्कर हो सकता है । क्योंकि इन मार्करों में से कोई भी वास्तव में CPCs के लिए विशिष्ट है, विभिंन मार्करों के संयोजन आमतौर पर लागू कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, CPCs एक्सप्रेस कम स्तर के सी-किट21, सी-किट भी अंय सेल प्रकार द्वारा व्यक्त की है, सहित मस्तूल कोशिकाओं22, endothelial कोशिकाओं23, और टेम स्टेम/जनक कोशिकाओं24। एक अतिरिक्त समस्या यह है कि सभी मार्करों सभी प्रजातियों में व्यक्त कर रहे है नहीं है । यह Sca-1 के लिए मामला है, जो माउस में नहीं बल्कि मानव25में व्यक्त करता है । इसलिए, प्रोटोकॉल है कि अलगाव मार्कर से स्वतंत्र है का उपयोग नैदानिक परीक्षणों और मानव नमूनों का उपयोग कर अध्ययन को देखने में लाभप्रद हो सकता है ।
मार्कर-स्वतंत्र आइसोलेशन तकनीक:
वहां सीपीसी अलगाव की कई प्रमुख तकनीक है, जो मुख्य रूप से सतह मार्कर अभिव्यक्ति के स्वतंत्र हैं, लेकिन जो विशिष्ट मार्कर के लगातार चयन से परिष्कृत किया जा सकता है के रूप में सकारात्मक उप आवश्यक (भी तालिका 1देखें) । (1) पक्ष जनसंख्या (सपा) तकनीक मूलतः टेम स्टेम कोशिकाओं के एक आदिम आबादी में विशेषता के आधार पर किया गया है डीएनए डाई Hoechst ३३३४२26 एटीपी द्वारा बाध्यकारी कैसेट (एबीसी)27ट्रांसपोर्टरों द्वारा समाप्ति । कार्डिएक सपा कोशिकाओं अलग समूहों द्वारा अलग किया गया है और रिपोर्ट2,8,13,14के बीच कुछ मामूली मतभेदों के साथ मार्करों की एक किस्म व्यक्त करने के लिए रिपोर्ट । (2) कॉलोनी बनाने इकाई fibroblast कोशिकाओं (CFU-Fs) मूल रूप से एक mesenchymal stromal सेल (एमएससी) के आधार पर परिभाषित किया गया है-जैसे phenotype । पृथक MSCs व्यंजन पर संस्कृति के लिए कॉलोनी गठन प्रेरित कर रहे हैं । ऐसी कॉलोनी बनाने वाली एमएससी-CFU-एफएस की तरह वयस्क दिल से अलग किया जा सकता है और कार्डियक वंश15में अंतर करने में सक्षम हैं । (3) Cardiosphere-व्युत्पन्न कोशिकाओं (सीडीसी) ऊतक बायोप्सी या explants28,29,30,31से बढ़ी कोशिकाओं के समूहों से व्युत्पंन एकल कोशिकाओं रहे हैं । यह हाल ही में दिखाया गया है कि ज्यादातर CD105+/CD90–/c-kit– सेल अंश प्रदर्शित cardiomyogenic और पुनर्अपक्षय क्षमता३२।
यहां, सपा-चूहों से अलग CPCs का उपयोग कर, हम endothelial वंश के कुशल प्रेरण चूहे CPCs और माउस SP-CPCs३३में एक पिछले अध्ययन के आधार पर के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । प्रोटोकॉल कोशिका घनत्व के संबंध में संस्कृति और विस्तार तकनीक के लिए विशिष्ट रूपांतरों, माध्यम के सीरम सामग्री, और सब्सट्रेट शामिल हैं । यह न केवल माउस सपा के लिए लागू किया जा सकता है CPCs लेकिन प्रयोजन के लिए CPCs के विभिंन प्रकार के लिए एक बढ़ाना से एक भाग्य स्विच प्रेरित करने के लिए एक endothelial-सीपीसी प्रतिबद्ध, यह इन कोशिकाओं या यंत्रवत के लिए उनके उपयोग के इन विट्रो अध्ययन में प्रत्यारोपण के ध्यान में रखना ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल के लाभ:
इस प्रोटोकॉल CPCs के एक endothelial भेदभाव तकनीक प्रदान करता है । हमने पाया है कि एक कम सीरम एकाग्रता और कम सेल घनत्व endothelial भेदभाव की क्षमता में सुधार, जिससे LN इन शर्तों के तहत एफ एन से अ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों के प्रयोगों के दौरान उसके मददगार समर्थन के लिए वेरा Lorenz का शुक्र है और चिकित्सा विभाग (DBM), विश्वविद्यालय और विश्वविद्यालय अस्पताल बेसल से फ्लो Cytometry सुविधा से कर्मचारियों । इस काम के रहने के द्वारा समर्थित था बेसल विश्वविद्यालय से ट्रैक कार्यक्रम पर (to Michika Mochizuki) । Gabriela एम Kuster स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 310030_156953) से एक अनुदान द्वारा समर्थित है ।
Materials
| Culture medium | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | 3.5% (0.1% for lineage induction) |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | Final concentration 2 mM |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #14170 | |
| 0.05 % Trypsin-EDTA | ThermoFisher | #25300 | |
| T75 Flask | Sarstedt | #83.3911 | |
| Endothelial differentiation | |||
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Ham's F-12K (Kaighn's) Medium | ThermoFisher | #21127 | |
| Laminin | Merck | #L2020 | |
| Fibronectin | Merck | #F4759 | Dilute in ddH2O |
| 6 Well Plate | Falcon | #353046 | |
| Formaldehyde Solution | Merck | #F1635 | Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration) |
| Triton X-100 | Merck | #93420 | 0.1% in ddH2O |
| Normal Goat Serum (10%) | ThermoFisher | #50062Z | |
| Anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | #ab6994 | 1:100 in 10% goat serum |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher | #A11010 | 1:500 in 10% goat serum |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) | ThermoFisher | #62247 | 1:500 in ddH2O |
| SlowFade Antifade Kit | ThermoFisher | #S2828 | |
| BX63 widefield microscope | Olympus | ||
| Tube formation | |||
| 96 Well Plate | Falcon | #353072 | |
| 5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap | Falcon | #352235 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | #354230 | |
| IX50 widefield microscope | Olympus | ||
| Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34 | |||
| Reagents | |||
| Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet. | in house hospital pharmacy | #9077862 | Working solution: 200 mg/kg |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #20012 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-) | ThermoFisher | #14175 | Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS for quenching Collagenase B activity |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate | ThermoFisher | #331885 | Prepare DMEM + 10% FBS + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| HEPES 1 M | ThermoFisher | #15630080 | Final concentration 25 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| RBC LysisBuffer (10X) | BioLegend | #420301/100mL | Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 µm filter |
| Collagenase B | Merck | #11088807001 | Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 µm filter |
| bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst) | Merck | #B2261 | Prepare 1 mg/mL in ddH2O |
| Verapamil-hydrochloride | Merck | #V4629 | Final concentration 83.3 µM |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | #551262 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BD Biosciences | #557405 | 0.6 µg/107cells |
| 7-Aminoactinomycin D (7-ADD) | ThermoFisher | #A1310 | 0.15 µg/106cells |
| APC rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #553932 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #554688 | 0.6 µg/107cells |
| Material | |||
| Needles 27G | Terumo | #NN-2719R | |
| Needles 18G | Terumo | #NN-1838S | |
| Single Use Syringes 1 mL sterile | CODAN | #62.1640 | |
| Transferpipette 3.5 mL | Sarstedt | #86.1171.001 | |
| Cell Strainer 40 µm blue | BD Biosciences | #352340 | |
| Cell Strainer 100 µm yellow | BD Biosciences | #352360 | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | #94.6077.305 | |
| Culture Dishes P100 | Corning | #353003 | |
| Culture Dishes P60 | Corning | #353004 | |
| Mouse | |||
| Line | Age | Breeding | |
| C57BL/6NRj / male | 12 weeks | in house | |
| Product Name | Company | Catalogue No. | |
| Reagents | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3. | |||
| Product Name | Medium 18 | Medium 2 | Medium 3 |
| Reagents | Culture | Lineage induction | Endothelial diff. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | 35% | 35% | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | 65% | 65% | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | 1% | 1% | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 3.5% | ≤0.1% | |
| L-Glutamine | 2 mM | 2 mM | |
| Glutathione | 0.2 nM | 0.2 nM | |
| B27 Supplement | 1.3% | ||
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | 6.5 ng/mL | ||
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | 13 ng/mL | ||
| Cardiotrophin 1 | 0.65 ng/mL | ||
Referências
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