Vi presenterar en metod för att upptäcka 3-nitrotyrosine kemiska modifieringar av atmosfäriska proteiner med 6 mm diameter rundor klippt från air sampler differenstryckmätning med högpresterande liquid chromatography-elektrokemisk detektor (HPLC-ECD).
3-nitrotyrosine (3-NT) genereras från tyrosin återstoden i atmosfäriska bio-aerosol proteiner via en reaktion med ozon (O3) och kvävedioxid (nr2). Stabil 3-NT är en specifik markör för oxidativ skada och rapporteras ha en hälsofrämjande effekt att framkalla allergier. I den aktuella studien redovisar vi utvecklingen av en mycket känslig analys att kvantifiera 3-NT i sampler luftfilter att samla < 2,5 µm partiklar (PM2,5) från urban miljö luft, inklusive bio-aerosol. I denna metod, en 6 mm diameter runda hål var klippt från filtren av luft provtagare och blandade med en ospecifik proteas cocktail för att hydrolysera proteiner. Protein prover rötas till amino syra nivå testades för 3-NT med högpresterande liquid chromatography-elektrokemisk detektor (HPLC-ECD). Den maximala halten i NT-3 upptäcktes i ett förfilter för PM i storlekar från 4,5 till 7,3 μm, med en detektionsgräns på 1,13 pg/m3.
Aerosol eller luftburna PM innehåller proteiner från olika biologiska ursprung, inklusive virus, prokaryoter, svampar, växter (pollen) och djur (insekter, mänskliga)1. Förhållandet av proteinhalten i PM uppskattas till nästan 5%, som har varit inblandade för att spela en viktig roll som en luftburna allergen2. Senaste rapporterna tyder på att urban omgivande aerosol av olika storlekar innehåller aminosyror med nyckeltal varierar mellan 0,5% och 2%3. Dessutom har kemiska modifieringar av PM proteiner föreslagits genereras av reaktionerna av proteiner med olika föroreningar, såsom O3kvävedioxid (nr2) och svaveldioxid (SO2)4.
3-NT — en protein modifiering — genereras av nitrering av tyrosin rester. En högre koncentration av O3 och nr2 har visat sig främja nitrering av proteinmolekyler i pseudo atmosfäriska utrymme5,6. Nitrering av tyrosin restprodukter i kedjan polypeptid förbättrar allergiframkallande pollen proteiner7. Således, kvantifiering och utvärdering av luftburna 3-NT är en viktig aspekt att ta itu med oro för miljöhälsa.
3-NT är också känd som en biomarkör för oxidativ och nitrosative betona8. En växande mängd bevis har visat en signifikant samband 3-NT innehåll med flera mänskliga sjukdomar9,10. På grund av dess skadliga effekter håll identifiering och kvantitativ uppskattning av 3-NT i ett biologiskt prov stor relevans vid bedömningen av villkoret om individens hälsa. Under senare år har olika metoder har införts för att uppskatta 3-NT innehållet, inklusive glykoproteinenzymkopplad immunadsorberande analyser, HPLC, och LC/MS11. I tidigare studier, har vi rapporterat en detektionsmetod med HPLC-ECD tekniken skänkt med flera fördelar jämfört med tidigare metoder. Till exempel kräver den HPLC-ECD inte ett utvinning eller derivatisering förfarande som gör det en relativt enkel analys system12. Vi har bekräftat att denna metod är tillämplig att upptäcka 3-NT från biologiska prover (plasma från människa och råtta).
Även om många utredningar har betonat att upptäcka 3-NT i biologiska prover, dess upptäckt i nonbiological prover förblir svårfångade, och därmed den aktuella studien har bedrivits. I själva verket för att bedöma den skadliga effekten av luftburna 3-NT, en kvantitativ metod som är användbar för upptäcka 3-NT direkt från luftburna partiklar krävs; därför vi tillämpat den befintliga HPLC-ECD-metoden att upptäcka 3-NT från PM2.5 samlas in på ett glas-fiber filter. Med hjälp av tekniken, 3-NT kunde upptäckas direkt från små bitar (6 mm diameter runda hål) av provet från ett PM samling filter. Vi har vidare utvärderas innehållet i 3-NT för olika PM storlekar och mätt detektionsgränsen för 3-NT. Den här artikeln föreslår en hög-känslig och hög genomströmning metod för att upptäcka 3-NT direkt från både nonbiological och biologiska prover.
Denna artikel beskriver en kvantifiering metod för att utvärdera 3-NT i luftburna PM samlat på quartz-filter med mycket känsliga HPLC-ECD tekniker.
I allmänhet har 3-NT mätmetoder utvecklats som biomarkörer för oxidativ stress i mänskliga sjukdomar. Antikroppsbaserade metoder (t.ex., den enzymkopplad immunosorbentanalys) betraktas som semikvantitativt eftersom det finns ingen strikt assay validering och det är svårt att bedöma testets tillförlitlighet. HPLC med elektrokemisk detektion (ECD) och mass spectrometry-baserade analyser har tillräcklig känslighet för kvantifiering av NT 3-13. Även om de är känsliga, mass spektrometri-baserade metoder som GC-MS eller GC-MS/MS kräver derivatisering av aminosyror, och processen för derivatisering ofta resulterar i bildandet av artefakter14.
Jämfört med både GC och LC tekniker, HPLC-ECD är relativt billigare och har en tillräcklig känslighet för åtgärd 3-NT. Dessutom steget derivatisering i GC-MS och LC-MS ofta kräver ytterligare tid. Även om metoden presenteras här kräver 16 timmar för protein matsmältningen steg, det kan dock utföras över natten (som beskrivits ovan, ca 30 minuter hands-on tid krävs per prov). Automatisk Upprepa mätning med hjälp av en autosampler föreskriva en hög genomströmning mätsystem. Tidigare studier har rapporterat immunologiska metoder att mäta 3-NT i PM2,7; sådana metoder kunde dock inte upptäcka 3-NT på vintern på grund av de låga nivåerna av 3-NT i PM15.
HPLC-ECD metoden har ytterligare fördelar över andra standardmetoder; exempelvis en extraktionsprocessen krävs inte i denna metod, (ii) det är helt fritt från rengöringsmedel, (iii) det har minimal prov krav och, ännu viktigare, (iv) den har hög känslighet. Partiklar som samlas in på filter är ofta åtskilda av ultraljudsbehandling för ytterligare undersökningar, inklusive kvantifiering av olika komponenter. Rengöringsmedel används också för att isolera PM-bundna proteiner från filter. Dock dessa ytterligare åtgärder ökar risken för kontaminering, prov förlust och underskattning på grund av utvinning effektivitet, och dessutom de flesta tvättmedel är oförenliga med LC/MS. I nuvarande HPLC-ECD-metoden kan HPLC prover lätt skiljas från filtret med hjälp av en enkel ihåliga punch och utan krav på ett ytterligare prov beredningsprocessen. Området i runda provet är 28,3 mm2som är mycket liten jämfört med storleken på det ursprungliga quartz-filtret (8 x 10 tum = 203,2 x 254 mm = 51,600 mm2).
HPLC-ECD villkoret har granskats noggrant för att undvika störningar på signalen 3-NT, som tidigare beskrivits12. En starkt sura pH Rörlig fas och en tillräcklig koncentration av acetonitril är viktigt för att upptäcka. Med dessa villkor, kan andra föreningar, inklusive nitro bas, skiljas från nitrotyrosine. Det nuvarande tillståndet är lämplig för detektion av 3-NT från prover med en annan fysisk egenskap (t.ex. partiklar och plasma).
För att utvärdera 3-NT i luften, mätning av filter vikt och eliminering av bakgrunden är kritiska moment. I allmänhet samlas över cirka 100 mg PM7 under en period av fyra till sju dagar. flera faktorer påverkar dock filter vikt före och efter samlingen PM7 , inklusive luftfuktighet och statisk elektrisk laddning. För att undvika dessa effekter, är stabiliseringen av filter vikt under långa perioder nödvändigt enligt subequal temperatur och luftfuktighet. Platsen där den elektroniska balansen är installerat bör hållas i en stabil miljö. För provberedning är det viktigt att korrigera bakgrund effekterna från den ospecifik proteasen cocktail och ultrafiltrering membranet, som ofta visar en liknande topp 3-NT.
Denna metod kan tillämpas på andra partiklar, bland annat i inomhusmiljöer. Nitrering av proteiner kan öka deras allergiframkallande potential2. Denna metod kan därför hjälpa att utvärdera miljö renlighet och förebygga nitrosative stress.
I denna studie redovisar vi en mycket känslig mätmetod för atmosfäriska 3-NT sampler luftfilter med billig utrustning för lätt att hantera. Generationen av 3-NT i atmosfären är associerad med miljögifter som O3, nr2, PM proteiner och meteorologiska faktorer som påverkar mänskliga allergiframkallande egenskaper. Sammanfattningsvis, kan den metod som utvecklats i denna undersökning hjälpa till att bedöma den atmosfäriska reaktionen O3, olika föroreningar och PM proteiner under olika meteorologiska förhållanden. Med dessa strävanden att utveckla HPLC-ECD för en uppskattning av 3-nitrotyrosine i atmosfären, räknar vi bättre miljö renlighet, förbättra människors hälsa.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Masayuki Kubo av den US Environmental Protection Agency för hans hjälp med tsk/PM2.5 provtagning. Detta arbete stöds delvis av JSPS KAKENHI Grant nummer JP16K15373 och JP18H03039.
Quartz filter, backup quartz filter | PALL life sciences | 7204 | Tissuquatrz 2500QAT-UP, 8x10in |
High-volume air sampler | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | HV-1000F | |
Particle size selector for SPM | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | 080130-061 | SPM (suspended particulate matters) is defined in Japan that particles with 10 um of 100% cut-off diameter. SPM is almost identical to PM7. |
Low-volume air sampler | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | AH-600F | |
Size classification unit for PM2.5 | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | AH-600 | |
Quartz filters for classification (PM4.5–2.5, PM7.3–4.5, PM15–7.3, and TSP-PM15) | Tokyo Dylec | AHQ-630 | |
Non-specific protease cocktail | Roche | 11459643001 | Pronase from Streptomyces griseus |
3-Nitrotyrosine | SIGMA | N7389 | |
Ultrafiltration membranes | Millipore | UFC5010BK | AMICON ULTRA 0.5 mL – 10kDa cutoff |
ECD | Eicom | HTEC-500, PEC-510 | standalone HPLC-ECD unit (HTEC-510) and Pre-electrolysis cell (PEC-510), includes pump |
HPLC column | Eicom | SC-5ODS | |
Data processor | Eicom | EPC-300 | |
Injector | Hitachi High-Tech Science | L-7200 | Auto sampler |
Analyzing software | eDAQ Japan | ES280 | PowerChrom software |