تسجيل الكهربية لنشاط الجهاز العصبي المركزي للطور الثالث Melanogaster المورفولوجية
Summary
ويصف هذا البروتوكول وسيلة لتسجيل النشاط الكهربائي تنازلي للنظام العصبي المركزي melanogaster المورفولوجية لتمكين فعالة من حيث التكلفة ومريحة لاختبار وكلاء الدوائية، الطفرات الوراثية للبروتينات العصبية، و/أو دور مسارات الفيزيولوجية غير مستكشفة.
Abstract
تستهدف معظم المبيدات الحشرية المتوفرة حاليا في الجهاز العصبي والطفرات الوراثية من اللافقاريات البروتينات العصبية في كثير من الأحيان تسفر عن عواقب وخيمة، ولكن الأساليب الحالية لتسجيل النشاط العصبي للفرد الحيوان مكلفة وشاقة. هذا الشفط الكهربائي إعداد النظام العصبي المركزي اليرقات الطور الثالث من melanogaster المورفولوجية، نظام المرونة لاختبار الآثار الفسيولوجية لوكلاء نيورواكتيفي، تحديد دور مختلف العصبية الفسيولوجية مسارات لنشاط الجهاز العصبي المركزي، فضلا عن تأثير الطفرات الوراثية للوظيفة العصبية. يتطلب هذا الإعداد السابقين فيفو معتدلة فقط تشريح المهارة والخبرة الكهربية لتوليد تسجيلات استنساخه من الحشرات نشاط الخلايا العصبية. يمكن تطبيق مجموعة متنوعة واسعة من المغيرون الكيميائية، بما في ذلك الببتيدات، ثم مباشرة إلى الجهاز العصبي في الحل مع المحلول الملحي الفسيولوجي لقياس تأثير على نشاط الجهاز العصبي المركزي. ويمكن تطبيق التكنولوجيات الوراثية، وأخرى، مثل نظام GAL4/UAS، بشكل مستقل، أو بالترادف مع وكلاء الدوائية لتحديد دور قنوات أيون معين أو الناقلين أو مستقبلات لوظيفة الجهاز العصبي المركزي المفصلية. وفي هذا السياق، الاختبارات المبينة في هذا التقرير من اهتمام كبير للسميات المبيدات الحشرية وفسيولوجي الحشرات، وعلماء الأحياء التنموية التي ميلانوجاستير دال- كائن حي نموذجية المتبعة. والهدف من هذا البروتوكول لوصف أسلوب الكهربية لتمكين قياس اليكتروجينيسيس للجهاز العصبي المركزي في الحشرة النموذجية، melanogaster المورفولوجية، ومفيدة لاختبار مجموعة متنوعة من العلمية فرضيات.
Introduction
والهدف العام لهذا النهج أن تمكن الباحثين من قياس سرعة اليكتروجينيسيس النظام العصبي المركزي (CNS) في الحشرة النموذجية، melanogaster المورفولوجية. هذا الأسلوب موثوق بها وسريعة وفعالة من حيث التكلفة لإجراء التجارب الفسيولوجية والسمية. الجهاز العصبي المركزي أمر ضروري للحياة، ومن ثم، الفسيولوجية المسارات الحرجة لتم استكشاف الوظيفة العصبية المناسبة على نطاق واسع في محاولة لفهم أو تعديل الوظيفة العصبية. توصيف لمسارات الإشارات داخل CNS المفصلية مكن اكتشاف عدة فئات المواد الكيميائية من مبيدات الحشرات التي تعطل وظيفة العصبية اللافقاريات للحث على معدل الوفيات مع الحد من عواقب خارج الهدف. وهكذا، القدرة على قياس النشاط العصبي للحشرات أهمية كبيرة في ميدان علم السموم الحشرات وعلم وظائف الأعضاء منذ العصبي هو النسيج المستهدف الأغلبية من مبيدات الحشرات المنتشرة1. حتى الآن، استمر نمو المعرفة الأساسية والتطبيقية المتعلقة بالحشرات الجهاز العصبي يتطلب تقنيات متقدمة العصبية التي تقتصر في جدوى، نظراً للتقنيات الحالية هي كثيفة العمالة، وتتطلب من نفقات عالية، الحشرات خطوط الخلايا العصبية محدودة، و/أو محدودية الوصول إلى نهايات المركزية معظم المفصليات. حاليا، يتطلب توصيف معظم البروتينات العصبية الحشرات المستهدفة لتكون المخدرات اللاحقة المستنسخة، وأعربت عن هيتيرولوجوسلي لاكتشاف والتسجيلات الكهربية، كما وصفت لقنوات البوتاسيوم مقومة الحشرات إلى الداخل2 ، ريانوديني الحشرات مستقبلات3، والبعوض حساسة للجهد ك+ قنوات4وغيرها. للتخفيف من الحاجة إلى تعبير مغايرة وإمكانيات التعبير الوظيفي المنخفض، مثقف بلومكويست والزملاء يهدف إلى الحث النمط الظاهري الخلايا العصبية في الخلايا فروجيبيردا سبودوبتيرا (Sf21) كطريقة مبتكرة مبيد حشري اكتشاف5،6. هذه الأساليب توفر نهجاً سليما لتطوير الكيمياء الجديدة، إلا أنها تخلق في كثير من الأحيان اختناق لا يمكن التغلب عليها لوصف العوامل الدوائية، تحديد آليات لمقاومة المبيدات الحشرية، وتوصيف المبادئ الفسيولوجية الأساسية. هنا، يمكننا وصف السابقين فيفو أسلوب الذي يتيح تسجيل النشاط الكهربائي من الحشرات نموذج يحتوي على علم الوراثة طيع7،،من89 وأنماط التعبير المعروفة من العصبية المجمعات11،،من1012 لتمكين توصيف آليات المقاومة على مستوى العصب وطريقة عمل الأدوية المطورة حديثا وغيرها من الدراسات السمية.
ذبابة الفاكهة، ميلانوجاستير دال، هو كائن نموذج مشترك لتعريف النظم العصبية الحشرات أو مبيد حشري إليه العمل وقد أنشئت ككائن نموذج مناسبة تماما لدراسة سمية13، الدوائي14 ،15و العصبية16و الفيزيولوجية المرضية17،،من1819،20 العمليات من الفقاريات. D.melanogaster هو الحشرات هولوميتابولوس الذي يقوم بمسخ كاملة، بما في ذلك مرحلة اليرقات والخوادر قبل الوصول إلى مرحلة الكبار الإنجابية. طوال عملية إنمائية، العصبي يخضع لإعادة عرض كبير في مراحل مختلفة من الحياة، ولكن CNS اليرقات ستتركز على هذه المنهجية. CNS اليرقات المتقدمة تماما بسيطة تشريحيا مع أجزاء الصدر والبطن التي تنصهر فيها، وتشكيل العقدة البطني، الذي يمثل مجموعة من الوحدات نيوروميريك متكررة ومتطابقة تقريبا21،22. الأعصاب الحركية تنازلي تنبع من نهاية العقد سوبيسوفاجيل والذيلية والنزول إلى يعصب عضلات جدار الجسم وأجهزة اليرقات الحشوي. ويصف الشكل 1 تشريح الإجمالي لليرقات المورفولوجية الجهاز العصبي المركزي.
يتطور في نهاية embryogenesis المورفولوجية حاجز الدم في الدماغ (BBB) ويتكون من سوببيرينيوريال الخلايا الدبقية (SPG)21. وتشكل الخلايا SPG العديد من عمليات مثل فيلوبوديا التي انتشرت بإنشاء ورقة عمل متجاورة، مسطحة للغاية، مثل بطانية يغطي المورفولوجية CNS كامل23. وقد المورفولوجية BBB أوجه التشابه مع BBB الفقارية، التي تشمل الحفاظ على التوازن المكروية العصبية بمراقبة دخول المواد الغذائية و xenobiotics إلى الجهاز العصبي المركزي21. هذا شرط مسبق للإرسال العصبية موثوقة ومهمة، حتى الآن حماية الجهاز العصبي المركزي واسطة BBB يقيد تخلل للعقاقير الاصطناعية ومعظم الببتيدات الأخرى xenobiotics24،25، الذي يقدم إمكانات مشاكل عند وصف مقايسات المغيرون جزيء صغير. يستخدم الأسلوب ترانسيكتيون بسيطة لتعطيل هذا الحاجز وتوفير وصول الدوائية جاهزة للاشتباكات العصبية المركزية.
هو أكبر قوة للمنهجية الموصوفة البساطة وإمكانية تكرار نتائج نسبيا الفائق القدرات الكامنة لهذا النظام. البروتوكول نسبيا سهلة الماجستير، يتطلب برنامج الإعداد مساحة صغيرة، وضروري فقط مدخلات مالية أولية التي ينخفض إلى الكواشف والمواد الاستهلاكية. علاوة على ذلك، طريقة وصف التعديل الكامل لتسجيل نشاط العصب المركزي تنازلي ذبابة المنزل، مستأنسة الذبابة26.
Protocol
Representative Results
Discussion
التفاصيل المقدمة في الفيديو المرتبطة بها وقدمت نص أداء الخطوات الرئيسية من أجل تسجيل النشاط وارتفاع تواتر المورفولوجية CNS السابقين فيفو. نجاعة التشريح هو الجانب الأكثر أهمية من الأسلوب لأنه سيقلل قصيرة أو عدد قليل من الخلايا العصبية تنازلي خط الأساس إطلاق معدل سوف تؤدي إلى الفر…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر السيدة روي تشن للتشريح وصور المورفولوجية الجهاز العصبي المركزي تظهر في الأرقام.
Materials
| Drosophila melanogaster (strain OR) | Bloomington Drosophila Stock Center | 2376 | |
| Vibration isolation table | Kinetic Systems | 9200 series | |
| Faraday Cage | Kinetic Systems | N/A | |
| Dissecting Microscope on a Boom | Nikon | SMZ800N | Multiple scopes can be used; boom stand is critical |
| AC/DC differential amplifier | ADInstruments | AM3000H | The model 1700 can be used instead of the model 3000 |
| audio monitor | ADInstruments | AM3300 | |
| Hum Bug Noise Eliminator | A-M Systems | 726300 | |
| Data Acquisition System (PowerLab) | ADInstruments | PL3504 | Multiple PowerLab models can be used. |
| Lab Chart Pro Software | ADInstruments | N/A – Online Download | |
| Fiber Optic Lights | Edmund Optics | 89-740 | Different light sources can be used, but fiber optics are the most adaptable |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M325 | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments | MEH715 | Different models are acceptable |
| BNC cables | World Precision Instruments | multiple based on size | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | PG52151-4 | |
| Microelectrode Puller | Sutter Instruments | P-1000 | Also can use Narashige PC-100 |
| Black Wax | Carolina Biological Supply | 974228 | |
| Non-coated insect pins, size #2 | Bioquip | 1208S2 | |
| Fince Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 |
Referências
- Sparks, T. C., Nauen, R. IRAC: Mode of action classification and insecticide resistance management. Pesticide Biochemistry and Physiology. 121, 122-128 (2015).
- Swale, D. R., et al. An insecticide resistance-breaking mosquitocide targeting inward rectifier potassium channels in vectors of Zika virus and malaria. Scientific Reports. 6, 36954 (2016).
- Troczka, B. J., et al. Stable expression and functional characterisation of the diamondback moth ryanodine receptor G4946E variant conferring resistance to diamide insecticides. Scientific Reports. 5, 14680 (2015).
- Bloomquist, J. R., et al. Voltage-sensitive potassium KV2 channels as new targets for insecticides. Biopesticides: State of the Art and Future Opportunities. 1172, 71-81 (2014).
- Jenson, L. J., Bloomquist, J. R. Role of serum and ion channel block on growth and hormonally-induced differentiation of Spodoptera frugiperda (Sf21) insect cells. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 90 (3), 131-139 (2015).
- Jenson, L. J., Sun, B., Bloomquist, J. R. Voltage-sensitive potassium channels expressed after 20-Hydroxyecdysone treatment of a mosquito cell line. Insect Biochemistry and Molecular Biolology. 87, 75-80 (2017).
- Chintapalli, V. R., Wang, J., Dow, J. A. Using FlyAtlas to identify better Drosophila melanogaster models of human disease. Nature Genetics. 39 (6), 715-720 (2007).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist’s Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).
- Luan, Z., Li, H. S. Inwardly rectifying potassium channels in Drosophila. Sheng Li Xue Bao. 64 (5), 515-519 (2012).
- Muenzing, S. E. A., et al. Larvalign: Aligning gene expression patterns from the larval brain of Drosophila melanogaster. Neuroinformatics. 16 (1), 65-80 (2017).
- Sprecher, S. G., Reichert, H., Hartenstein, V. Gene expression patterns in primary neuronal clusters of the Drosophila embryonic brain. Gene Expression Patterns. 7 (5), 584-595 (2007).
- Zhou, S., et al. A Drosophila model for toxicogenomics: Genetic variation in susceptibility to heavy metal exposure. PLoS Genetics. 13 (7), e1006907 (2017).
- Manev, H., Dimitrijevic, N. Drosophila model for in vivo pharmacological analgesia research. European Journal of Pharmacology. 491 (2-3), 207-208 (2004).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacological Reviews. 63 (2), 411-436 (2011).
- Hekmat-Scafe, D. S., Lundy, M. Y., Ranga, R., Tanouye, M. A. Mutations in the K+/Cl- cotransporter gene kazachoc (kcc) increase seizure susceptibility in Drosophila. Journal of Neuroscience. 26 (35), 8943-8954 (2006).
- Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson’s disease. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102 (22), 8024-8029 (2005).
- Watson, M. R., Lagow, R. D., Xu, K., Zhang, B., Bonini, N. M. A Drosophila model for amyotrophic lateral sclerosis reveals motor neuron damage by human SOD1. Journal of Biological Chemistry. 283 (36), 24972-24981 (2008).
- Rajendra, T. K., et al. A Drosophila melanogaster model of spinal muscular atrophy reveals a function for SMN in striated muscle. Journal of Cell Biology. 176 (6), 831-841 (2007).
- Chan, H. Y., Bonini, N. M. Drosophila models of human neurodegenerative disease. Cell Death and Differentiation. 7 (11), 1075-1080 (2000).
- Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium. Frontiers in Neuroscience. 8, 365 (2014).
- Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. L., Whitington, P. M., Technau, G. M. Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila. Journal of Neuroscience. 31 (44), 15870-15883 (2011).
- Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila. Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Abbott, N. J., Dolman, D. E., Patabendige, A. K. Assays to predict drug permeation across the blood-brain barrier, and distribution to brain. Current Drug Metabolism. 9 (9), 901-910 (2008).
- Swale, D. R., Sun, B., Tong, F., Bloomquist, J. R. Neurotoxicity and mode of action of N, N-diethyl-meta-toluamide (DEET). PLoS One. 9 (8), e103713 (2014).
- Hafer, N., Schedl, P. Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (1), 85 (2006).
- Bloomquist, J. R. Mode of action of atracotoxin at central and peripheral synapses of insects. Invertebrate Neuroscience. 5 (1), 45-50 (2003).
- Bloomquist, J. R., Roush, R. T., ffrench-Constant, R. H. Reduced neuronal sensitivity to dieldrin and picrotoxinin in a cyclodiene-resistant strain of Drosophila melanogaster (Meigen). Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 19 (1), 17-25 (1992).
- Mutunga, J. M., et al. Neurotoxicology of bis(n)-tacrines on Blattella germanica and Drosophila melanogaster acetylcholinesterase. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 83 (4), 180-194 (2013).
- Chen, R., Swale, D. R. Inwardly rectifying potassium (Kir) channels represent a critical ion conductance pathway in the nervous systems of insects. Scientific Reports. 8 (1), 1617 (2018).
- Francis, S. A., Taylor-Wells, J., Gross, A. D., Bloomquist, J. R. Toxicity and physiological actions of carbonic anhydrase inhibitors to Aedes aegypti and Drosophila melanogaster. Insects. 8 (1), 2 (2016).
- Swale, D. R., et al. Inhibitor profile of bis(n)-tacrines and N-methylcarbamates on acetylcholinesterase from Rhipicephalus (Boophilus) microplus and Phlebotomus papatasi. Pesticide Biochemistry and Physiology. 106 (3), 85-92 (2013).
- Corbel, V., et al. Evidence for inhibition of cholinesterases in insect and mammalian nervous systems by the insect repellent deet. BMC Biology. 7, 47 (2009).
