Denne protokol beskriver en metode til at registrere den faldende elektriske aktivitet i Drosophila melanogaster centralnervesystemet at muliggøre omkostningseffektive og praktisk afprøvning af farmakologiske midler, genetiske mutationer af neurale proteiner, og/eller rollen af uudforskede fysiologiske veje.
Fleste af de aktuelt tilgængelige insekticider målrette nervesystemet og genetiske mutationer af hvirvelløse neurale proteiner give oftentimes skadelige konsekvenser, men de nuværende metoder til registrering af nervesystemet aktivitet af en individuel dyret er dyre og besværlige. Denne suge elektrode forberedelse af tredje-instar larve centrale nervesystem af Drosophila melanogaster, er en tractable system for at teste de fysiologiske virkninger af neuroactive agenter, bestemmelse af forskellige neurale fysiologiske betydning veje til CNS aktivitet samt påvirkning af genetiske mutationer til neurale funktion. Denne ex vivo forberedelse kræver kun moderat dissekere dygtighed og elektrofysiologiske ekspertise til at generere reproducerbare optagelser af insekt neuronal aktivitet. En lang række kemiske modulatorer, herunder peptider, kan derefter anvendes direkte på nervesystemet i løsning med fysiologisk saltvand til at måle indflydelse på CNS aktivitet. Yderligere, genetiske teknologier, såsom ordningen for GAL4/UAS kan anvendes uafhængigt eller i tandem med farmakologiske agenter til at fastslå rollen specifikke Ionkanaler, transportører eller receptorer til leddyr CNS funktion. I denne forbindelse er assays beskrevet heri af væsentlig interesse for insekticid toksikologer, insekt fysiologer og udviklingsmæssige biologer, D. melanogaster er en etableret model organisme. Målet med denne protokol er at beskrive en elektrofysiologiske metode hen til muliggøre måling af electrogenesis af det centrale nervesystem i model insekt, Drosophila melanogaster, som er nyttig ved afprøvning af en mangfoldighed af videnskabelige hypoteser.
Det overordnede mål med denne tilgang er at sætte forskerne hurtigt måle electrogenesis af det centrale nervesystem (CNS) i model insekt, Drosophila melanogaster. Denne metode er pålidelig, hurtig og omkostningseffektiv til at udføre fysiologiske og toksikologiske forsøg. CNS er afgørende for liv og derfor den kritiske fysiologiske veje for ordentlig neurale funktion har været undersøgt grundigt i et forsøg på at forstå eller ændre neurale funktion. Karakterisering af den signaling veje inden for leddyr CNS har aktiveret opdagelsen af flere kemiske klasser af insekticider, der forstyrrer hvirvelløse neurale funktion til at fremkalde dødelighed samtidig begrænse off target konsekvenser. Evnen til at måle den neurale aktivitet af insekter er således af væsentlig interesse for feltet insekt toksikologi og fysiologi nervesystemet er målvæv af fleste af indsat insekticider1. Alligevel fortsatte vækst af grundforskning og anvendt viden om insekt nervesystemet kræver avancerede neurofysiologiske teknikker, der er begrænset i gennemførlighed, da nuværende teknikker er arbejdsintensive og kræver en høj regning, insekt neurale cellelinjer er begrænset, og/eller der er begrænset adgang til de centrale synapser af de fleste leddyr. I øjeblikket, kræver karakterisering af de fleste insekt neurale proteiner det mål at blive klonet og heterologously gav udtryk for efterfølgende drug discovery og elektrofysiologiske optagelser, som blev beskrevet for insekt indad ensretter kalium kanaler2 , insekt ryanodine receptor3, myg spænding-følsomme K+ kanaler4, m.fl. For at dæmpe kravet om Heterolog ekspression og mulighederne for at lave funktionelle udtryk, Bloomquist og kolleger havde til formål at fremkalde en neuronal fænotype i kulturperler Spodoptera frugiperda (Sf21) celler som en roman metode for insekticid discovery5,6. Disse metoder giver en gyldig tilgang til udvikling af nye kemi, men de skaber ofte en uoverstigelig flaskehals for karakterisering af farmakologiske midler, at identificere mekanismer af insekticidresistens og karakterisering grundlæggende fysiologiske principper. Her, beskriver vi en ex vivo -metode, der muliggør registrering af elektrisk aktivitet fra en model insekt, der har plastisk genetik7,8,9 og kendte udtryk mønstre af neurale komplekser10,11,12 aktivere karakterisering af resistensmekanismer på niveau af nerven, virkningsmekanisme af nyudviklede narkotika og andre toksikologiske undersøgelser.
Frugtflue, D. melanogaster, er en fælles model organisme for at definere insekt neurale systemer eller insekticid virkningsmekanisme og er blevet etableret som en velegnet model organisme for undersøgelse af toksikologiske13, farmakologiske14 ,15, neurofysiologiske16og patofysiologiske17,18,19,20 processer af hvirveldyr. D.melanogaster er en holometabolous insekt, der udfører komplet metamorfose, herunder en larve og puppe stadie før de når den reproduktive voksne fase. I hele den udviklingsmæssige proces, nervesystemet gennemgår betydelige remodellering på forskellige livsstadier, men larver CNS vil være i fokus i denne metode. Den fuldt udviklede larve CNS er anatomisk enkel med bryst- og abdominal-segmenter, der er smeltet og danne den ventrale ganglion, som repræsenterer en bred vifte af gentagne og næsten identiske neuromeric enheder21,22. Faldende motoriske nerver stammer fra den caudale årets subesophageal ganglier og ned for at innerverer kroppen væggen muskler og viscerale organer af larverne. Figur 1 beskriver brutto anatomi af den larve Drosophila CNS.
Drosophila blod – hjerne barrieren (BBB) udvikler sig i slutningen af embryogenese og er dannet af subperineurial glial celler (SPG)21. SPG celler danner talrige filopodia-lignende processer, der spredes ud til at etablere en sammenhængende, meget flad, endotel-lignende ark, der dækker det hele Drosophila CNS23. Drosophila BBB har ligheder med hvirveldyr BBB, som omfatter bevarelse homeostase af de neurale mikromiljø ved styring optagelse af næringsstoffer og fremmedstoffer i CNS21. Dette er en forudsætning for pålidelige neurale transmission og funktion, men beskyttelse af CNS af BBB begrænser gennemtrængning af syntetiske stoffer, de fleste peptider og andre fremmedstoffer24,25, som introducerer potentiale problemer når kendetegner kræfter af små-molekyle modulatorer. Metoden bruger en simpel transection til at afbryde denne barriere og give klar farmakologiske adgang til de centrale synapser.
Den største styrke af den beskrevne metode er enkelhed, reproducerbarhed og relativt høj overførselshastighed kapacitet iboende til dette system. Protokollen er relativt let at mestre, setup kræver lidt plads, og kun en indledende finansielle input er nødvendig som er reduceret til reagenser og hjælpematerialer. Yderligere, den beskrevne metode er helt ændres til at optage den centrale faldende nerve aktivitet af huset flue, Musca domestica26.
Oplysninger i den tilhørende video og tekst har givet vigtige trin for at registrere aktivitet og spike decharge hyppigheden af Drosophila CNS ex vivo. Dissektion effektivitet er det mest kritiske aspekt af metoden for korte eller par faldende neuroner vil mindske den oprindelige fyring sats, som vil resultere i store afvigelser mellem replikater. Men når dissektion teknik har været behersket, de indsamlede data med denne analyse er meget reproducerbare og ændres til en bred vifte af discipliner. En…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Ms. Rui Chen for dissektion og billeder af Drosophila CNS vist i figurerne.
Drosophila melanogaster (strain OR) | Bloomington Drosophila Stock Center | 2376 | |
Vibration isolation table | Kinetic Systems | 9200 series | |
Faraday Cage | Kinetic Systems | N/A | |
Dissecting Microscope on a Boom | Nikon | SMZ800N | Multiple scopes can be used; boom stand is critical |
AC/DC differential amplifier | ADInstruments | AM3000H | The model 1700 can be used instead of the model 3000 |
audio monitor | ADInstruments | AM3300 | |
Hum Bug Noise Eliminator | A-M Systems | 726300 | |
Data Acquisition System (PowerLab) | ADInstruments | PL3504 | Multiple PowerLab models can be used. |
Lab Chart Pro Software | ADInstruments | N/A – Online Download | |
Fiber Optic Lights | Edmund Optics | 89-740 | Different light sources can be used, but fiber optics are the most adaptable |
Micromanipulator | World Precision Instruments | M325 | |
Microelectrode Holder | World Precision Instruments | MEH715 | Different models are acceptable |
BNC cables | World Precision Instruments | multiple based on size | |
Glass Capillaries | World Precision Instruments | PG52151-4 | |
Microelectrode Puller | Sutter Instruments | P-1000 | Also can use Narashige PC-100 |
Black Wax | Carolina Biological Supply | 974228 | |
Non-coated insect pins, size #2 | Bioquip | 1208S2 | |
Fince Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 |