Mate-bevakning beteende spelar en viktig roll i reproduktionen av tidvattenzonen hoppkräftor av släktet Tigriopus. Metoder för att studera detta beteende har dock inte varit väl beskrivna. Här beskriver vi metoder för: 1) enskilda kultur oskuld Tigriopus djur, och 2) kvantitativ analys av deras mate-bevakning beteende.
Hoppkräftor av släktet Tigriopus, som är gemensamma djurplankton i steniga tide pooler, visar precopulatory mate-bevakning beteende där en manlig knäppen en potentiell kompis att bilda ett par. Medan detta fenomen har rönt intresse av forskare, har metoder för sin analys inte väl beskrivna. Här beskriver vi förfaranden för: 1) enskilda odling och iscensättning av Tigriopus ungdomar och vuxna, och 2) video-baserad analys av deras mate-bevakning beteende. Metoden culturing gör experimentell kontroll av fanersvarvning erfarenhet av djur samt möjlighet att spåra deras utveckling innan beteendemässiga tester. Analysmetoden som tillåter kvantitativ utvärdering av flera aspekter av mate-bevakning beteende, inklusive fånga försök av hanar och simning banan för mate-bevakning par. Även om dessa metoder var ursprungligen etablerade för etologiska studier på Tigriopus, med lämpliga ändringar de kan också tillämpas på studier av andra djurplankton i olika forskningsområden, såsom fysiologi, toxikologi, och ekologiska genetik.
Tidvattenzonen hoppkräftor av släktet Tigriopus är spridda i steniga hög tidvattenzonen pooler över flera kontinenter1. Dessa hoppkräftor uppvisar mate-bevakning beteende som en del av deras reproduktion, där en vuxen man fångar en potentiell kompis (juvenil eller vuxen) utnyttja dess hakas första antenner innan parning (figur 1 och figur 2)2 ,3,4,5. Även om detta fenomen har varit föremål för etologiska och biokemiska studier för årtionden2,3,6,7, detaljerade förfaranden för studier av detta beteende, inklusive enskilda kultur av virgin djur och kriterierna i behavioral händelserna i ett mate-bevakning försök, har inte väl beskrivna. Alltså fastställa här vi metoder för att aktivera studier av beteende under en kontrollerad experimentell miljö.
Enskilda odling och iscensättning av djur
Tidigare studier av reproduktion av Tigriopus sysselsatt konventionellt ett par avtagning metod för att förbereda ungdomar (copepodids) och vuxna honor för beteendemässiga tester och avel experiment3,8,9 ,10. Denna metod tillåter dock djur bildar par och potentiellt att kopulera före tester (diskuteras i Ito 198811), som kan förändra beteendemässiga egenskaper hos djur5. Dessutom finns det också en potential att missbedöma utvecklingsstadier av Hoppkräftor med de konventionella protokoll som de är beroende av uppenbara kroppsstorlek för mellanlagring. I detta papper beskriver vi en individuell culturing metod som används i vår senaste studie med Tigriopus californicus5, som var utformad för att hantera dessa begränsningar genom att styra hopkoppling erfarenhet av djur och spåra deras utveckling från copepodid till vuxna stadier.
Kvantitativ analys av mate-bevakning beteende
Mate-bevakning beteendet hos Tigriopus arter har undersökts inte bara inom etologi2,6 , men också inom andra områden såsom ekotoxikologi och Evolutionär genetik3,4, 7 , 8 , 9 , 10. men de tidigare studierna har förklarat loppet av problemet främst i skrivna former utan tillräcklig visuella illustrationer att beskriva både beteende och metoder för att studera det, vilket skapar tekniska hinder för den replikering och befordran av studierna. Här, tillhandahåller vi detaljerade beskrivningar av några av de viktigaste händelserna i mate-bevakning beteendet hos Tigriopus hoppkräftor stöds av visuellt material. Vi visar även utrustning och metoder för kvantitativ analys av beteendet. Dessa metoder kan utvärdering av beteendemässiga egenskaper av djur under mate-bevakning försök i just replikerade experiment.
Med dessa metoder vill vi ge en metodologisk grund av kontrollerade och reproducerbara undersökningar på beteendet mate-bevakning av släktet Tigriopus.
Enskilda odling och bestämning av scenen och kön
Här beskrev vi den metod som används i vår tidigare studie5 för att förbereda oskuld Tigriopus djur med deras hopkoppling erfarenhet som kontrolleras vid spårning av deras utveckling (figur 4 och figur 7). Som Tigriopus arter utnyttjas som modell djur i olika biologiska områden såsom toxikologi16,18, ekologiska fysiologi19,20,21, och evolutionära genetik13,22,23,24, denna metod har en potential att ge ett värdefullt sätt att bedöma påverkan av miljö och genetiska faktorer på livscykeln för dessa hoppkräftor.
För att uppnå framgångsrik förproduktion, vanlig sökning och samling av CI är copepodids från en massa kultur (steg 1.2) kritisk, eftersom samling i senare skeden kan leda till felaktig iscensättning av djuren. Dessutom är en grundlig söka avsked (steg 1.3) också viktigt för korrekt stadieindelning. Öka frekvensen för insamling och mellanlagring vid behov eftersom intervallet mellan molts varierar från en till flera dagar beroende på art och uppfödning skick2,25,26. Skillnader i antenner morfologi mellan copepodids och vuxna honor är inte synbart signifikanta i vissa arter och populationer av Tigriopus16,25. Mellanlagring före könsbestämning är därför bra att skilja vuxna honor från avancerade copepodids av båda könen.
Beteendemässiga tester och manuell analys av beteendemässiga egenskaper
I allmänhet är en av de mest kritiska delarna av etologiska studier definition och beskrivning av händelser av intresse. Metoder som införs i detta papper först utvecklades för vår senaste studie5 och kompletteras med en beskrivning av parning och de visuella hjälpmedlen (figur 10). I tillägg till detta, spelar konsekvens i djurhantering också en viktig roll i beteende experiment. Till exempel sköljning av Hoppkräftor potentiellt kan underlätta vissa aspekter av deras beteende (kompletterande Figur1) och är därför önskvärt att utföras på ett konsekvent sätt bland prover, såsom standardiserade i steg 2.1.3. Vi förväntar oss de material som tillhandahålls i denna uppsats kommer att hjälpa kontrollerade och reproducerbara studier på Tigriopus, att främja reproduktiv och ekologiska studier av denna rikliga invånaren av högvatten pool mate-bevakning beteende.
En möjlig begränsning med denna metod är låg förstoring av erhållna bilder. Även filmer som är inspelade med vårt system tillåter identifiering av framstående kroppens strukturer inklusive urosomes och manliga första antenner, kan man inte kunna observera mer subtila strukturer såsom ben och genitalier med vår metod eftersom det inte anställer mikroskopiska förstoring för videoinspelning. Medan Kelly et al. rapporterade att de kunde iaktta spermatofor överföra från män till kvinnor av T. japonicus under en mikroskopisk observation på 100 X förstoring (ingen video inspelad)7, har vi inte kunnat iaktta en spermatofor i våra filmer, kanske på grund av begränsningen av bildens upplösning.
Tvådimensionell spårning av par
Även om denna metod inte tillåter tredimensionell spårning av djur, möjliggör det tvådimensionell bana analys av djurplankton utan kemiskt märkning djur (cf. Ister et al. 201027) genom att utnyttja program som distribueras gratis. Om storleken på en filmfil är för stor för att behandlas i ImageJ, kan minska upplösningen av filen och omvandla det till en film i gråskala. Medan den beskrivna metoden utvecklades ursprungligen för vuxna parar av T. californicus (figur 12 och figur 13), finns det även för vuxen-ung par och enskilda individer (kompletterande Figur1) som liksom andra Tigriopus arter i princip. Vi förväntar oss ytterligare metoden är tillämplig på kort sikt (från vilken millisekund till de andra tidsskalor) bana analys av djurplankton av andra taxa med lämpliga justeringar.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av bidrag från den Sumitomo Foundation, Japan (Grant för grundläggande forskningsprojekt, bevilja nummer: 150932) och forskning institutet av havslevande ryggradslösa djur, Japan (2018 enskilda forskningsbidrag) till STI och RSB samt ett bidrag från USA National Science Foundation (DEB-1556466) till RSB. Vi tackar Ms. Kiana Michelle Woodward för feedback på metoden odling och mellanlagring.
Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands. Inc. | SS1-160P | For preparation of culture medium |
PRO PlecoWafers | Tetra | 16447 | Food for copepods (used after being ground in a mortar) |
Flat bottom 6-well tissue culture plate with lid | Corning Co., Ltd. | 353224 | Container for culture of gravid females and hatched nauplii |
Flat bottom 24-well cell culture plate with lid | Corning Co., Ltd. | 353226 | Container for individual culturing |
Flat bottom 48-well cell culture plate with lid | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 748001 | Behavioral observation chambers |
LED light pad | Shenzhen Huion Animation Technology Co., Ltd. | Litup LP4 | Backlight for behavioral observation |
Camera | Canon | 0591C003 (model: Rebel T6i) | For recording of behavior |
Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | For transfer of copepods |
P10 micropipette tips | VWR | 613-0735 | For transfer of C1 stage copepodids |
ImageJ | NIH | Version 1.49t | For semi-automatic analysis of movies |
MTrackJ | Version 1.5.1 | ImageJ plugin for tracking developed by Dr. Erik Meijering (Biomedical Imaging Group Rotterdam, Erasmus University Medical Center, The Netherlands) |