Kompis vokter atferd spiller en viktig rolle i reproduksjon av fjæra Raudåta av slekten Tigriopus. Metoder for å studere dette har imidlertid ikke blitt beskrevet. Her beskriver vi metoder for: 1) individuell kultur jomfru Tigriopus dyr og 2) kvantitativ analyse av sin kompis vokter atferd.
Raudåta av slekten Tigriopus, som er vanlig dyreplankton i steinete tidevann bassenger, viser precopulatory kompis vokter oppførsel der en mannlig hekter en potensiell kompis å danne et par. Mens dette fenomenet vakte interessen av, har metoder for analysen ikke blitt beskrevet. Her beskriver vi prosedyrer for: 1) individuell dyrking og regi av Tigriopus barn og voksne, og 2) video-basert analyse av sin kompis vokter atferd. Metoden culturing aktiverer eksperimentelle kontroll over paring opplevelsen av dyr samt muligheten til å spore deres utvikling før atferdsmessige tester. Metoden analyse kan kvantitativ vurdering av flere deler av mate-vokte atferd, inkludert fange forsøk av menn og svømming bane av kompis vokter. Selv om disse metodene ble opprinnelig etablert for etologiske studier på Tigriopusmed riktige modifikasjoner de kan også brukes til studier av andre dyreplankton i forskjellige forskningsfelt, som fysiologi, toksikologi, og økologiske genetikk.
Fjæra Raudåta av slekten Tigriopus er vidt distribuert i steinete høy fjæra bassenger over flere kontinenter1. Disse Raudåta oppfører kompis vokter som en del av deres reproduksjon, der en voksen mann fanger en potensiell kompis (juvenile eller voksen) utnytte sin første hekta antenner før copulation (figur 1 og figur 2)2 ,3,4,5. Selv om dette fenomenet har vært gjenstand for etologiske og biokjemiske studier for tiår2,3,6,7, detaljerte prosedyrer for studier av dette problemet, inkludert Personlige kultur, jomfru dyr og kriterier atferdsmessige hendelsesforløpet i en kompis vokter forsøk, har ikke blitt beskrevet. Dermed etablere her vi metoder for å aktivere studier av under et kontrollert eksperimentelle miljø.
Individuelle dyrking og iscenesettelse av dyr
Tidligere studier av reproduksjon av Tigriopus ansatt konvensjonelt et par frakobling metoden for å forberede yngel (copepodids) og voksne kvinner atferdsmessige tester og avl eksperimenter3,8,9 ,10. Men tillater denne metoden dyr å danne par og potensielt pare før tester (omtalt i Ito 198811), som kan endre atferdsmessige egenskaper dyr5. I tillegg er det også mulighet til å bedømme galt utviklingsstadier av Raudåta med vanlige protokoller som de er avhengige av tilsynelatende kroppsstørrelse for regi. I dette papir beskriver vi en individuell culturing metoden som brukes i vår siste undersøkelse med Tigriopus californicus5, som ble utviklet for å håndtere disse begrensningene ved å kontrollere paring opplevelsen av dyr og spore deres utvikling fra copepodid til voksne stadier.
Kvantitativ analyse av kompis vokter atferd
Kompis vokter atferden til Tigriopus arter har blitt undersøkt ikke bare innen etologi2,6 , men også i andre områder som økotoksikologi og evolusjonær genetikk3,4, 7 , 8 , 9 , 10. imidlertid de tidligere studiene har forklart i løpet av dette hovedsakelig i skrevet skjemaer uten tilstrekkelig visuelle illustrasjoner skissere både virkemåten og metodene for å studere, som skaper tekniske hindringer for den replikering og fremme av studiene. Her gir vi detaljerte beskrivelser av noen av de viktigste hendelsene i kompis vokter atferden til Tigriopus Raudåta støttes av visuelle materialer. Vi viser også utstyr og metoder for kvantitativ analyse av atferd. Disse metodene tillater evaluering av atferdsmessige egenskaper av dyr under kompis vokter forsøk nettopp replikerte eksperimenter.
Med disse metodene mål å tilby en metodisk basis av kontrollert og reproduserbar studier på kompis vokter virkemåten av slekten Tigriopus.
Individuelle dyrking og fastsetting av scenen og sex
Her beskrev vi metoden som brukes i våre tidligere studie5 for å forberede jomfru Tigriopus dyr med deres paring opplevelsen kontrollert under sporing av deres utvikling (Figur 4 og figur 7). Som Tigriopus arter benyttes som modell dyr i ulike biologiske som toksikologi16,18, økologiske fysiologi19,20,21, og evolusjonære genetikk13,22,23,24, denne metoden har et potensial til å gi en verdifull måte å vurdere påvirkning av miljømessige og genetiske faktorer på disse Raudåta livssyklus.
For å oppnå vellykket regi, vanlig søk og samling av CI er copepodids fra en masse kultur (trinn 1.2) avgjørende fordi samlingen ved senere stadier kan føre mis iscenesettelse av dyrene. I tillegg er en grundig søk etter exuviae (trinn 1.3) også avgjørende for nøyaktig regi. Øke frekvensen av innsamling og staging eventuelt som intervallet mellom molts varierer fra en til flere dager avhengig av Art og oppdrett betingelse2,25,26. Forskjeller i antenner morfologi mellom copepodids og voksne kvinner er ikke synlig betydelig i noen arter og bestander av Tigriopus16,25. Derfor er oppsetning før sexing nyttig å skille voksne hunner fra avanserte copepodids av begge kjønn.
Atferdsmessige tester og manuell analyse av atferdsmessige egenskaper
Generelt, er en av de viktigste delene av etologiske studier definisjon og beskrivelse av hendelser av interesse. Metodene i denne artikkelen ble først utviklet for vår siste studie5 og supplert med beskrivelsen av copulation og visuelle hjelpemidler (Figur 10). I tillegg til at spiller konsistens i dyr håndtering også en viktig rolle i atferdsmessige eksperimenter. For eksempel skylling av Raudåta kan potensielt lette noen aspekter av deres atferd (supplerende figur 1) og derfor er ønskelig utføres på en konsekvent måte blant eksemplene, som standardisert i trinn 2.1.3. Vi forventer materiell i denne artikkelen vil hjelpe kontrollert og reproduserbar studier på kompis vokter oppførselen til Tigriopus, fremme reproduktiv og økologiske studier av dette rikelig innbygger i høyt tidevann bassenger.
En mulig begrensning med denne metoden er lav forstørrelse innhentet bilder. Selv om filmer med vårt system tillater identifikasjon av fremtredende kropp strukturer inkludert urosomes og mannlige første antenner, kan man ikke kunne observere mer subtile strukturer som bein og kjønnsorganer med vår metode siden det ikke ansette mikroskopiske forstørrelsen for video opptak. Mens Kelly et al. rapporterte at de klarte å observere spermatophore overføre fra menn til kvinner av T. japonicus under en mikroskopisk observasjon på 100 X forstørrelse (ingen video registrert)7, vi har ikke kunnet observere en spermatophore i våre filmer, kanskje på grunn av begrensning av bildeoppløsningen.
Todimensjonal sporing av parene
Selv om denne metoden ikke tillater tredimensjonale sporing av dyr, gjør det todimensjonal banen analyse av dyreplankton uten merking kjemisk dyr (cf. Smult et al. 201027) ved å bruke programmer distribuert gratis. Hvis størrelsen på en filmfil er for stor til å bli behandlet i ImageJ, kan redusere oppløsningen til filen og konvertere den til en grå skala film. Mens metoden beskrevet ble opprinnelig utviklet for voksen par T. californicus (Figur 12 og figur 13), er det også tilgjengelig for voksen-yngel par og enkelt enkeltpersoner (supplerende figur 1) som andre Tigriopus arter i prinsippet. Vi forventer ytterligere metoden skal gjelder for kortsiktige (fra millisekundet til de andre tidsskalaer) banen analyse av dyreplankton av andre taxa med nødvendige justeringer.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet er støttet av tilskudd fra Sumitomo Foundation, Japan (stipend for grunnleggende vitenskap forskningsprosjekter, gi nummer: 150932) og Research Institute av Marine dyr, Japan (2018 personlige forskningsstipend) til STI og RSB stipend fra USA National Science Foundation (DEB-1556466) til RSB. Vi takker Ms. Kiana Michelle Woodward for tilbakemelding på metoden dyrking og oppsett.
Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands. Inc. | SS1-160P | For preparation of culture medium |
PRO PlecoWafers | Tetra | 16447 | Food for copepods (used after being ground in a mortar) |
Flat bottom 6-well tissue culture plate with lid | Corning Co., Ltd. | 353224 | Container for culture of gravid females and hatched nauplii |
Flat bottom 24-well cell culture plate with lid | Corning Co., Ltd. | 353226 | Container for individual culturing |
Flat bottom 48-well cell culture plate with lid | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 748001 | Behavioral observation chambers |
LED light pad | Shenzhen Huion Animation Technology Co., Ltd. | Litup LP4 | Backlight for behavioral observation |
Camera | Canon | 0591C003 (model: Rebel T6i) | For recording of behavior |
Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | For transfer of copepods |
P10 micropipette tips | VWR | 613-0735 | For transfer of C1 stage copepodids |
ImageJ | NIH | Version 1.49t | For semi-automatic analysis of movies |
MTrackJ | Version 1.5.1 | ImageJ plugin for tracking developed by Dr. Erik Meijering (Biomedical Imaging Group Rotterdam, Erasmus University Medical Center, The Netherlands) |