Incorporação de genética de biossintetizados L-dihidroxifenilalanina (DOPA) e sua aplicação à conjugação de proteína

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para a incorporação genética de L-dihidroxifenilalanina biossintetizados a partir de matérias-primas simples e sua aplicação à conjugação de proteínas.

Resumo

L-dihidroxifenilalanina (DOPA) é um aminoácido encontrado na biossíntese de catecolaminas em animais e plantas. Devido às suas propriedades bioquímicas particulares, o aminoácido tem múltiplos usos em aplicações bioquímicas. Este relatório descreve um protocolo para a constituição genética de biossintetizados DOPA e sua aplicação à conjugação de proteínas. DOPA é biossintetizados por uma tirosina fenol-liase (TPL) de catecol, piruvato e amônia, e o aminoácido é diretamente incorporado em proteínas pelo método de incorporação genética usando um aminoacil-tRNA evoluída e par de aminoacil-tRNA sintetase. Este sistema de incorporação directa eficientemente incorpora DOPA com pouca incorporação de outros aminoácidos naturais e com melhor rendimento de proteína do que o anterior sistema de incorporação genética para DOPA. Conjugação de proteínas com proteínas contendo DOPA é eficiente e site-specific e mostra sua utilidade para diversas aplicações. Este protocolo fornece os cientistas de proteína com procedimentos detalhados para o eficiente biossíntese de proteínas mutantes contendo DOPA em sites desejados e sua conjugação para aplicações industriais e farmacêuticas.

Introdução

DOPA é um aminoácido envolvido na biossíntese de catecolaminas em animais e plantas. Este aminoácido é sintetizado a partir de Tyr tirosina hidroxilase e oxigênio molecular (O₂)¹. Porque DOPA é um precursor da dopamina e pode permear a barreira sangue - cérebro, ela tem sido usada no tratamento da doença de Parkinson². DOPA também é encontrada em proteínas de adesão de mexilhão (mapas), que são responsáveis para as propriedades adesivas de mexilhões em circunstâncias molhadas^3,4,5,6<....

Protocolo

1. plasmídeo construção

1. Construir um plasmídeo de expressão (pBAD-duplo TPL-GFP-WT) que expressa o gene da TPL de Citrobacter freundii sob o controle de um promotor constitutivo e o gene da proteína verde fluorescente (GFP) com seus₆-etiqueta sob o controle da promotor de araBAD. Para pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG, substitua o códon para o site (E90) da DOPA com um códon âmbar (TAG), usando um protocolo de mutagenesis local-dirigido. Os detalhes para a construção deste plasmídeo foi descrito em nosso anterior relatório¹⁸.
2. Construa um tRNA/aaRS-expressando plasmídeo (pEVOL-DHPRS2)^18....

Resultados

O sistema de expressão para a incorporação directa do DOPA biossintetizados de um TPL é mostrado na Figura 1. Os genes para o par aa-tRNA e aaRS evoluído são colocados em um plasmídeo e o gene da GFP (GFP-E90TAG) que contém um códon âmbar na posição 90 situa-se em mais um plasmídeo para avaliar a incorporação de DOPA por fluorescência de GFP. O gene TPL é colocado no mesmo plasmídeo de expressão contendo o gene da GFP e constitutivamente expressa para maximiz.......

Discussão

Neste protocolo, a biossíntese e incorporação directa do DOPA são descritos. A célula bacteriana usada neste método pode sintetizar um aminoácido adicional e usá-lo como um bloco de construção natural para a síntese de proteína. A incorporação genética de aminoácidos não naturais tem sido uma tecnologia-chave para o desenvolvimento do organismo natural com um código genético expandido. No entanto, este método tem sido tecnicamente incompleto e está sendo modificado para melhorar a eficiência da incorporação e minimizar a.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1. Construção de plasmídeo
Plasmídeo pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG			opcionalmente contém o códon de parada âmbar (TAG) em uma posição desejada. Ko, W. et al. Marcação de anticorpos eficiente e específica do local por cicloadição de azida-alcino promovida por cepa. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
Plasmídeo pEvol-DHPRS2			1. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., e Schultz, P. G. Um sistema aprimorado para mutagênese de aminoácidos não naturais em E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Incorporação genética de l-dihidroxifenilalanina (DOPA) biossintetizada por uma tirosina fenol-liase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018).
DH10β	Invitrogen	C6400-03	Expression Host Plasmid
Mini-prep kit	Nucleogen	5112	200/pacote
Agarose	Intron biotechnology	32034	500 g
Brometo de etídio	Alfa Aesar	L07482	1 g
LB Caldo	BD Difco	244620	500 g
2. Preparação da cultura
2.1) Eletroporação
Micro pulsador	BIO-RAD	165-2100
Cubeta micro pulsadora	BIO-RAD	165-2089	Folga do eletrodo de 0,1 cm, pacote de 50
Ampicilina Sódica	Wako	018-10372	25 g
Cloranfenicol	Alfa Aesar	B20841	25 g
Ágar	SAMCHUN	214230	500 g
SOC médio	Sigma	S1797	100 mL
3. Expressão e purificação de GFP-E90DOPA por sistema biossintético
3.1 Expressão de GFP-E90DOPA por sistema biossintético
L(+)-Arabinose, 99%	Acros	104981000	100 g
Pirocatecol, 99%	SAMCHUN	P1387	25 g
Sulfato de amônio, 99%	SAMCHUN	A0943	500 gramas
ácido pirúvico, 98%	Alfa Aesar	A13875	100 g
Fosfato de sódio dibásico, anidro, 99%	SAMCHUN	S0891	1 kg
Fofato de potássio, monobásico, 99%	SAMCHUN	P1127	1 kg
Sulfato de magnésio, anidro, 99%	SAMCHUN	M0146	1 kg
D(+)-Glicose, anidro, 99%	SAMCHUN	D0092	500 g
Glicerol, 99%	SAMCHUN	G0269	1 kg
Mistura de metais traço a5 com co	Sigma	92949	25 mL
L-Prolina, 99%	SAMCHUN	P1257	25 g
L-fenilalanina, 98,5%	SAMCHUN	P1982	25 g
L-triptofano	JUNSEI	49550-0310	25 g
L-arginina, 98%	SAMCHUN	A1149	25 g
L-Glutamina, 98%	JUNSEI	27340-0310	25 g
L-Asparagina monohidratada, 99%	SAMCHUN	A1198	25 g
L-Metionina	JUNSEI	73190-0410	25 g
Cloridrato de L-Histidina monohidratado, 99%	SAMCHUN	H0604	25 g
L-Treonina, 99%	SAMCHUN	T2938	25 g
L-Leucina	JUNSEI	87070-0310	25 g
de glicina, 99%	SAMCHUN	G0286	25 g
de ácido L-glutâmico, 99%	SAMCHUN	G0233	25 g
de L-alanina, 99%	SAMCHUN	A1543	25 g
de L-isoleucina, 99%	SAMCHUN	I1049	25 g
de L-valina, 99%	SAMCHUN	V0088	25 g
de L-serina	SAMCHUN	S2447	25 g
de ácido L-aspártico	SAMCHUN	A1205	25 g
de monocloridrato de L-lisina, 99%	SAMCHUN	L0592	25 g
3.2 Lise celular
imidazol, 99%	SAMCHUN	I0578	1kg
Fosfato de sódio monobásico, 98%	SAMCHUN	S0919	1 kg
Cloreto de sódio, 99%	SAMCHUN	S2907
Processador ultrassônico de 1 kg - 150 microlitros a 150 mililitros	SONIC & MATERIAIS	VCX130
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography
Ni-NTA resina	QIAGEN	30210	25 mL
Coluna de polipropileno	QIAGEN	34924	50/pacote, capacidade de 1 mL
4. Oligomerização de GFP-E90DOPA  Purificado < / forte >
periodato de sódio, 99,8 e	Acros	419610050	5 g
5. Conjugação de GFP-E90DOPA com uma sonda de alcino por ciclooctileno controlado por oxidação promovida por tensão– Cicloadição de 1,2-quinona (SPOCQ)
Cy5.5-ADIBO	FutureChem	FC-6119	1mg
6. Purificação de filtros centrífugos rotulados GFP
Amicon Ultra 0,5 mL	MILLIPORE	UFC500396	96/pacote, capacidade de 500ul
7. Análise SDS-PAGE e Varredura de Gel de Fluorescência
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99,5	Sigma	10708984001	10 g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X	Thermofisher	NP0007	10 mL
MES running buffer	Thermofisher	NP0002	500 mL
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE géis	Thermofisher	NO0321	12 bem
Coomassie Azul Brilhante R-250	Wako	031-17922	25 g
G:BOX Chemi Fluorescente & Sistema de imagem quimioluminescente	Syngene		G BOX Chemi XT4
8. Análise MALDI-TOF MS por digestão de tripsina
8.1 Preparação da amostra de peptídeo digerido por digestão de tripsina
Tris(hidroximetil)aminometano, 99%	SAMCHUN	T1351	500 g
Ácido clorídrico, 35~37%	SAMCHUN	H0256	500 mL
de sal de sódio de sulfato de dodecil, 85%	SAMCHUN	D1070	250 g
Iodoacetamida	Sigma	I6125	5 g
Tripsina Protease, Grau MS	Thermofisher	90057	5 x 20 µ g/pack
Colunas de spin C-18	Thermofisher	89870	25/pack, 200 µ L capacidade
8,2 Análise do peptídeo digerido por MALDI-TOF
Acetonitirila, 99,5%	SAMCHUN	A0125	500 mL
&alfa;-ciano-4-hidroxicinâmico ácido	Sigma	C2020	10 g
Ácido trifluoroacético, 99%	SAMCHUN	T1666	100 g
MTP 384 placa-alvo alvos BC de aço retificado		Bruker
Bruker Autoflex da velocidade MALDI-TOF	Bruker

% Espectrômetro maciço 8280784