Hier presenteren we een protocol voor de genetische opneming van L-dihydroxyphenylalanine levende van eenvoudige grondstoffen en de toepassing ervan op eiwit-vervoeging.
L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) is een aminozuur gevonden in de biosynthese van catecholamines in dieren en planten. Wegens zijn bepaalde biochemische eigenschappen heeft het aminozuur meerdere toepassingen in biochemische toepassingen. Dit verslag beschrijft een protocol voor de genetische opneming van levende DOPA en de toepassing ervan op eiwit-vervoeging. DOPA is levende door een tyrosine fenol-lyase (TPL) van catechol en pyruvaat ammoniak en het aminozuur wordt direct opgenomen in eiwitten door de genetische methode met behulp van een geëvolueerd aminoacyl-tRNA / aminoacyl-tRNA synthetase-paar. Deze directe opneming systeem omvat efficiënt DOPA met weinig opneming van andere natuurlijke aminozuren en betere eiwit opbrengst dan bij de vorige genetische opneming systeem voor DOPA. Eiwit-vervoeging met DOPA-bevattende eiwitten is efficiënt en site-specifieke en toont het nut ervan voor verschillende toepassingen. Dit protocol biedt eiwit wetenschappers met gedetailleerde procedures voor de efficiënte biosynthese van mutant eiwitten bevattende DOPA op gewenste sites en hun vervoeging voor industriële en farmaceutische toepassingen.
DOPA is een aminozuur die betrokken zijn bij de biosynthese van catecholamines in dieren en planten. Dit aminozuur wordt gesynthetiseerd uit Tyr door tyrosine hydroxylase en moleculaire zuurstof (O2)1. Omdat DOPA een precursor van dopamine is en de bloed – hersen-barrière kan doordringen, is het gebruikt bij de behandeling van de ziekte van Parkinson2. DOPA wordt ook gevonden in Mossel hechting eiwitten (MAPs), die verantwoordelijk voor de adhesieve eigenschappen van mosselen in natte omstandigheden3,4,5,6,7 zijn. Tyr is aanvankelijk gecodeerd op de posities waar DOPA wordt gevonden in kaarten en vervolgens wordt omgezet in DOPA door tyrosinases8,9. Wegens zijn interessante biochemische eigenschappen, is DOPA gebruikt in een verscheidenheid van toepassingen. De dihydroxyl groep van DOPA chemisch gevoelig is voor oxidatie, en het aminozuur wordt gemakkelijk omgezet in L-dopaquinone, een voorloper van melanines. Vanwege de hoge electrophilicity, zijn L-dopaquinone en derivaten daarvan gebruikt voor crosslinking en vervoeging met thiolen en aminen10,11,12,13. 1,2-quinones kunnen ook functioneren als een dieen voor cycloadditie reacties en zijn gebruikt voor bioconjugation door stam-bevorderd oxidatie-gecontroleerde cyclooctyne-1,2-Chinon (SPOCQ) cycloadditie14. Bovendien, de dihydroxyl-groep kan chelaat metaalionen zoals Fe3 + en Cu2 +, en eiwitten bevattende DOPA hebben gebruikt voor drug delivery en metaalion sensing15,16.
DOPA is genetisch eiwitten omgezet met behulp van een orthogonale aminoacyl-tRNA (aa-tRNA) en het aminoacyl-tRNA synthetase (jaarlijkse activiteitenverslagen) paar17 en gebruikt voor eiwit conjugatie en crosslinking10,11, 12,,13. In dit verslag, worden experimentele resultaten en protocollen voor de genetische opneming van DOPA levende van goedkope grondstoffen en de toepassingen voor de bioconjugation beschreven. DOPA is levende met behulp van een TPL en vanaf catechol en pyruvaat ammoniak in Escherichia coli. De levende DOPA is het direct opgenomen in eiwitten met een geëvolueerd aa-tRNA en jaarlijkse activiteitenverslagen paar DOPA uit te spreken. Daarnaast is het levende eiwit met DOPA site-specifically geconjugeerd met een fluorescente sonde en kruisverwijzende voor de productie van eiwitten oligomeren. Dit protocol zal nuttig zijn voor eiwit wetenschappers, biosynthesize mutant eiwitten bevattende DOPA en conjugaat van de eiwitten met de biochemische sondes of drugs voor industriële en farmaceutische toepassingen.
In dit protocol, worden de biosynthese en directe opneming van DOPA beschreven. De bacteriële cel gebruikt bij deze methode kan een extra aminozuur te synthetiseren en gebruik het als een onnatuurlijke bouwsteen voor eiwitsynthese. De genetische opneming van onnatuurlijke aminozuren is een belangrijke technologie voor de ontwikkeling van onnatuurlijke organisme met een uitgebreide genetische code. Echter, deze methode heeft technisch onvolledig en is wordt gewijzigd om de efficiëntie van de opneming en minimaliseren va…
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek werd gesteund door de Global Frontier Research Program (NRF-2015M3A6A8065833), en de fundamentele wetenschap Research Program (2018R1A6A1A03024940) door de nationale onderzoek Stichting van Korea (NRF) gefinancierd door de regering van Korea.
1. Plasmid Construction | |||
Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG | optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
Plasmid pEvol-DHPRS2 | 1. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of l-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018). | ||
DH10β | Invitrogen | C6400-03 | Expression Host |
Plasmid Mini-prep kit | Nucleogen | 5112 | 200/pack |
Agarose | Intron biotechnology | 32034 | 500 g |
Ethidium bromide | Alfa Aesar | L07482 | 1 g |
LB Broth | BD Difco | 244620 | 500 g |
2. Culture preparation | |||
2.1) Electroporation | |||
Micro pulser | BIO-RAD | 165-2100 | |
Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50 |
Ampicillin Sodium | Wako | 018-10372 | 25 g |
Chloramphenicol | Alfa Aesar | B20841 | 25 g |
Agar | SAMCHUN | 214230 | 500 g |
SOC medium | Sigma | S1797 | 100 mL |
3. Expression and Purification of GFP-E90DOPA by biosynthetic system | |||
3.1 Expression of GFP-E90DOPA by biosynthetic system | |||
L(+)-Arabinose, 99% | Acros | 104981000 | 100 g |
Pyrocatechol, 99% | SAMCHUN | P1387 | 25 g |
Ammonium sulfate, 99% | SAMCHUN | A0943 | 500 g |
pyruvic acid, 98% | Alfa Aesar | A13875 | 100 g |
Sodium phosphate dibasic, anhydrous, 99% | SAMCHUN | S0891 | 1 kg |
Potassium phophate, monobasic, 99% | SAMCHUN | P1127 | 1 kg |
Magnesium sulfate, anhydrous, 99% | SAMCHUN | M0146 | 1 kg |
D(+)-Glucose, anhydrous, 99% | SAMCHUN | D0092 | 500 g |
Glycerol, 99% | SAMCHUN | G0269 | 1 kg |
Trace metal mix a5 with co | Sigma | 92949 | 25 mL |
L-Proline, 99% | SAMCHUN | P1257 | 25 g |
L-Phenylalanine, 98.5% | SAMCHUN | P1982 | 25 g |
L-Tryptophane | JUNSEI | 49550-0310 | 25 g |
L-Arginine, 98% | SAMCHUN | A1149 | 25 g |
L-Glutamine, 98% | JUNSEI | 27340-0310 | 25 g |
L-Asparagine monohydrate, 99% | SAMCHUN | A1198 | 25 g |
L-Methionine | JUNSEI | 73190-0410 | 25 g |
L-Histidine hydrochloride monohydrate, 99% | SAMCHUN | H0604 | 25 g |
L-Threonine, 99% | SAMCHUN | T2938 | 25 g |
L-Leucine | JUNSEI | 87070-0310 | 25 g |
Glycine, 99% | SAMCHUN | G0286 | 25 g |
L-Glutamic acid, 99% | SAMCHUN | G0233 | 25 g |
L-Alanine, 99% | SAMCHUN | A1543 | 25 g |
L-Isoleucine, 99% | SAMCHUN | I1049 | 25 g |
L-Valine, 99% | SAMCHUN | V0088 | 25 g |
L-Serine | SAMCHUN | S2447 | 25 g |
L-Aspartic acid | SAMCHUN | A1205 | 25 g |
L-Lysine monohydrochloride, 99% | SAMCHUN | L0592 | 25 g |
3.2 Cell lysis | |||
Imidazole, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1kg |
Sodium phosphate monobasic, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1 kg |
Sodium Chloride, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1 kg |
Ultrasonic Processor – 150 microliters to 150 milliliters | SONIC & MATERIALS | VCX130 | |
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography | |||
Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | 25 mL |
Polypropylene column | QIAGEN | 34924 | 50/pack, 1 mL capacity |
4. Oligomerization of Purified GFP-E90DOPA | |||
Sodium periodate, 99.8& | Acros | 419610050 | 5 g |
5. Conjugation of GFP-E90DOPA with an Alkyne Probe by Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne–1,2-Quinone Cycloaddition (SPOCQ) | |||
Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1mg |
6. Purification of Labeled GFP | |||
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters | MILLIPORE | UFC500396 | 96/pack, 500ul capacity |
7. SDS-PAGE Analysis and Fluorescence Gel Scanning | |||
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 % | Sigma | 10708984001 | 10 g |
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X | Thermofisher | NP0007 | 10 mL |
MES running buffer | Thermofisher | NP0002 | 500 mL |
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels | Thermofisher | NO0321 | 12 well |
Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25 g |
G:BOX Chemi Fluorescent & Chemiluminescent Imaging System | Syngene | G BOX Chemi XT4 | |
8. MALDI-TOF MS analysis by Trypsin Digestion | |||
8.1 Preparation of the digested peptide sample by trypsin digestion | |||
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500 g |
Hydrochloric acid, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500 mL |
Dodecyl sulfate sodium salt, 85% | SAMCHUN | D1070 | 250 g |
Iodoacetamide | Sigma | I6125 | 5 g |
Trypsin Protease, MS Grade | Thermofisher | 90057 | 5 x 20 µg/pack |
C-18 spin columns | Thermofisher | 89870 | 25/pack, 200 µL capacity |
8.2 Analysis of the digested peptide by MALDI-TOF | |||
Acetonitirile, 99.5% | SAMCHUN | A0125 | 500 mL |
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma | C2020 | 10 g |
Trifluoroacetic acid, 99% | SAMCHUN | T1666 | 100 g |
MTP 384 target plate ground steel BC targets | Bruker | 8280784 | |
Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker |