Constitution génétique biosynthétisée L-dihydroxyphénylalanine (DOPA) et son Application à la conjugaison de protéine
Summary
Nous présentons ici un protocole pour la constitution génétique de L-dihydroxyphénylalanine biosynthétisée à partir de matières premières simples et son application à la conjugaison de la protéine.
Abstract
L-dihydroxyphénylalanine (DOPA) est un acide aminé présent dans la biosynthèse des catécholamines dans les animaux et les plantes. En raison de ses propriétés biochimiques particulières, l’acide aminé a des utilisations multiples applications biochimiques. Ce rapport décrit un protocole pour la constitution génétique de biosynthétisée DOPA et son application à la conjugaison de la protéine. DOPA est biosynthétisée par une tyrosine phénol-lyase (TPL) de catéchol, le pyruvate et l’ammoniac et l’acide aminé est incorporé directement dans des protéines par la méthode de constitution génétique utilisant un aminoacyl-tRNA évoluée et paire d’aminoacyl-tRNA synthétase. Ce système d’incorporation directe intègre efficacement DOPA avec peu d’incorporation d’autres acides aminés naturels et avec le meilleur rendement de protéine que le précédent système de constitution génétique pour DOPA. Conjugaison de protéine avec des protéines contenant de DOPA est efficace et spécifique au site et montre son utilité pour des applications diverses. Ce protocole prévoit scientifiques de protéine avec des procédures détaillées pour la biosynthèse efficace de protéines mutantes contenant DOPA aux sites désirés et leur conjugaison pour applications industrielles et pharmaceutiques.
Introduction
DOPA est un acide aminé impliqué dans la biosynthèse des catécholamines dans les animaux et les plantes. Cet acide aminé est synthétisé à partir de Tyr par la tyrosine hydroxylase et la molécule de dioxygène (O2)1. Parce que la DOPA est un précurseur de la dopamine et peut pénétrer la barrière hémato – encéphalique, il a été utilisé dans le traitement de la maladie de Parkinson,2. DOPA se trouve également dans les protéines d’adhérence moule (cartes), qui sont responsables des propriétés adhésives des moules dans des conditions humides3,4,5,6,7. Tyr est initialement codé dans les positions où la DOPA se trouve dans les cartes et est ensuite converti en DOPA par tyrosinases8,9. En raison de ses propriétés biochimiques intéressantes, DOPA a été utilisé dans une variété d’applications. Le groupe dicarbométhoxyl de DOPA est chimiquement sujets à l’oxydation, et l’acide aminé est facilement transformé en L-dopaquinone, un précurseur des mélanines. En raison de son caractère électrophile haut, L-dopaquinone et ses dérivés ont été utilisés pour la réticulation et conjugaison avec les thiols et amines10,11,12,13. 1, 2-quinones peuvent également fonctionner comme un diène pour les réactions de cycloaddition et ont été utilisés pour bioconjugaison par contrainte-favorisé oxydation contrôlée cyclooctyne-1,2-quinone (SPOCQ) cycloaddition14. En outre, le groupe dicarbométhoxyl peut chélater les ions métalliques tels que Fe3 + et Cu2 +, et les protéines contenant DOPA ont été utilisés pour l’administration des médicaments et des ions métalliques détection15,16.
DOPA a été génétiquement incorporé dans les protéines en utilisant un orthogonal aminoacyl-ARNt (aa-ARNt) et aminoacyl-ARNt synthétase (RAA) paire17 et utilisé pour la protéine conjugaison et réticulation10,11, 12,,13. Dans le présent rapport, les résultats expérimentaux et des protocoles pour la constitution génétique de DOPA biosynthétisée à partir de matières premières bon marchés et de ses applications à bioconjugaison sont décrits. DOPA est biosynthétisée à l’aide d’un TPL et à partir de catéchol, le pyruvate et l’ammoniac chez Escherichia coli. La biosynthèse DOPA est directement incorporée dans les protéines en exprimant une paire aa-ARNt et aaRS évoluée pour DOPA. En outre, la protéine biosynthétisée contenant la DOPA est relativement conjuguée avec une sonde fluorescente et réticulé pour produire des oligomères de protéine. Ce protocole sera utile pour les scientifiques de protéine, à biosynthétiser les protéines mutantes contenant DOPA et conjuguer les protéines avec sondes biochimiques ou de médicaments destinés à des applications industrielles et pharmaceutiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, la biosynthèse et l’incorporation directe de DOPA sont décrites. La cellule bactérienne utilisée dans cette méthode peut synthétiser un acide aminé supplémentaire et utilisez-le comme un bloc de construction artificiel pour la synthèse des protéines. La constitution génétique des acides aminés non naturels a été une technologie clé pour le développement de l’organisme contre nature avec un code génétique élargi. Toutefois, cette méthode a été techniquement incomplète et est …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par le programme de recherche Global Frontier (FRO-2015M3A6A8065833), et le programme de recherche sciences fondamentales (2018R1A6A1A03024940) grâce à la Fondation de recherche National de Corée (NRF) financé par le gouvernement de la Corée.
Materials
| 1. Plasmid Construction | |||
| Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG | optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
| Plasmid pEvol-DHPRS2 | 1. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of l-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018). | ||
| DH10β | Invitrogen | C6400-03 | Expression Host |
| Plasmid Mini-prep kit | Nucleogen | 5112 | 200/pack |
| Agarose | Intron biotechnology | 32034 | 500 g |
| Ethidium bromide | Alfa Aesar | L07482 | 1 g |
| LB Broth | BD Difco | 244620 | 500 g |
| 2. Culture preparation | |||
| 2.1) Electroporation | |||
| Micro pulser | BIO-RAD | 165-2100 | |
| Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50 |
| Ampicillin Sodium | Wako | 018-10372 | 25 g |
| Chloramphenicol | Alfa Aesar | B20841 | 25 g |
| Agar | SAMCHUN | 214230 | 500 g |
| SOC medium | Sigma | S1797 | 100 mL |
| 3. Expression and Purification of GFP-E90DOPA by biosynthetic system | |||
| 3.1 Expression of GFP-E90DOPA by biosynthetic system | |||
| L(+)-Arabinose, 99% | Acros | 104981000 | 100 g |
| Pyrocatechol, 99% | SAMCHUN | P1387 | 25 g |
| Ammonium sulfate, 99% | SAMCHUN | A0943 | 500 g |
| pyruvic acid, 98% | Alfa Aesar | A13875 | 100 g |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous, 99% | SAMCHUN | S0891 | 1 kg |
| Potassium phophate, monobasic, 99% | SAMCHUN | P1127 | 1 kg |
| Magnesium sulfate, anhydrous, 99% | SAMCHUN | M0146 | 1 kg |
| D(+)-Glucose, anhydrous, 99% | SAMCHUN | D0092 | 500 g |
| Glycerol, 99% | SAMCHUN | G0269 | 1 kg |
| Trace metal mix a5 with co | Sigma | 92949 | 25 mL |
| L-Proline, 99% | SAMCHUN | P1257 | 25 g |
| L-Phenylalanine, 98.5% | SAMCHUN | P1982 | 25 g |
| L-Tryptophane | JUNSEI | 49550-0310 | 25 g |
| L-Arginine, 98% | SAMCHUN | A1149 | 25 g |
| L-Glutamine, 98% | JUNSEI | 27340-0310 | 25 g |
| L-Asparagine monohydrate, 99% | SAMCHUN | A1198 | 25 g |
| L-Methionine | JUNSEI | 73190-0410 | 25 g |
| L-Histidine hydrochloride monohydrate, 99% | SAMCHUN | H0604 | 25 g |
| L-Threonine, 99% | SAMCHUN | T2938 | 25 g |
| L-Leucine | JUNSEI | 87070-0310 | 25 g |
| Glycine, 99% | SAMCHUN | G0286 | 25 g |
| L-Glutamic acid, 99% | SAMCHUN | G0233 | 25 g |
| L-Alanine, 99% | SAMCHUN | A1543 | 25 g |
| L-Isoleucine, 99% | SAMCHUN | I1049 | 25 g |
| L-Valine, 99% | SAMCHUN | V0088 | 25 g |
| L-Serine | SAMCHUN | S2447 | 25 g |
| L-Aspartic acid | SAMCHUN | A1205 | 25 g |
| L-Lysine monohydrochloride, 99% | SAMCHUN | L0592 | 25 g |
| 3.2 Cell lysis | |||
| Imidazole, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1kg |
| Sodium phosphate monobasic, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1 kg |
| Sodium Chloride, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1 kg |
| Ultrasonic Processor – 150 microliters to 150 milliliters | SONIC & MATERIALS | VCX130 | |
| 3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography | |||
| Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | 25 mL |
| Polypropylene column | QIAGEN | 34924 | 50/pack, 1 mL capacity |
| 4. Oligomerization of Purified GFP-E90DOPA | |||
| Sodium periodate, 99.8& | Acros | 419610050 | 5 g |
| 5. Conjugation of GFP-E90DOPA with an Alkyne Probe by Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne–1,2-Quinone Cycloaddition (SPOCQ) | |||
| Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1mg |
| 6. Purification of Labeled GFP | |||
| Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters | MILLIPORE | UFC500396 | 96/pack, 500ul capacity |
| 7. SDS-PAGE Analysis and Fluorescence Gel Scanning | |||
| 1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 % | Sigma | 10708984001 | 10 g |
| NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X | Thermofisher | NP0007 | 10 mL |
| MES running buffer | Thermofisher | NP0002 | 500 mL |
| Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels | Thermofisher | NO0321 | 12 well |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25 g |
| G:BOX Chemi Fluorescent & Chemiluminescent Imaging System | Syngene | G BOX Chemi XT4 | |
| 8. MALDI-TOF MS analysis by Trypsin Digestion | |||
| 8.1 Preparation of the digested peptide sample by trypsin digestion | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500 g |
| Hydrochloric acid, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500 mL |
| Dodecyl sulfate sodium salt, 85% | SAMCHUN | D1070 | 250 g |
| Iodoacetamide | Sigma | I6125 | 5 g |
| Trypsin Protease, MS Grade | Thermofisher | 90057 | 5 x 20 µg/pack |
| C-18 spin columns | Thermofisher | 89870 | 25/pack, 200 µL capacity |
| 8.2 Analysis of the digested peptide by MALDI-TOF | |||
| Acetonitirile, 99.5% | SAMCHUN | A0125 | 500 mL |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma | C2020 | 10 g |
| Trifluoroacetic acid, 99% | SAMCHUN | T1666 | 100 g |
| MTP 384 target plate ground steel BC targets | Bruker | 8280784 | |
| Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker |
Referências
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