Genetisk innlemmelse av Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) og sin søknad til Protein Bøyning
Summary
Her presenterer vi en protokoll for genetisk inkorporering av L-dihydroxyphenylalanine biosynthesized fra enkle Start materialer og sin søknad til protein Bøyning.
Abstract
L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) er en aminosyre som finnes i biosyntesen av katekolaminer i dyr og planter. På grunn av bestemt biokjemiske egenskaper har aminosyren flere bruker i biokjemiske programmer. Denne rapporten beskriver en protokoll for genetisk inkorporering av biosynthesized DOPA og sin søknad til protein Bøyning. DOPA er biosynthesized av en tyrosin fenol-lyase (TPL) fra catechol, pyruvate og ammoniakk aminosyren er direkte tatt inn proteiner av genetisk innlemmelse metoden bruker en utviklet aminoacyl-tRNA og aminoacyl-tRNA synthetase par. Direkte tilknyttet systemet inkorporerer effektivt DOPA med lite innlemmelse av andre naturlige aminosyrer og bedre protein avkastning enn forrige genetisk innlemmelse systemet for DOPA. Protein Bøyning med DOPA inneholder proteiner er effektiv og områdespesifikke og viser nytten for ulike applikasjoner. Denne protokollen gir protein forskere med detaljerte prosedyrer for effektiv biosyntesen av mutant proteiner som inneholder DOPA på ønskede områder og deres Bøyning for industri og farmasøytiske.
Introduction
DOPA er en aminosyre som er involvert i biosyntesen av katekolaminer i dyr og planter. Denne aminosyren er syntetisert fra Tyr av tyrosin hydroksylase og molekylære oksygen (O2)1. Fordi DOPA er en forløper til dopamin og kan trenge gjennom blod – hjerne barrieren, har det vært brukt i behandling av Parkinsons sykdom2. DOPA er også funnet i blåskjell vedheft proteiner (kart), som er ansvarlig for egenskapene selvklebende blåskjell i våte forhold,3,,4,,5,,6,,7. Tyr er opprinnelig kodet på plasseringen der DOPA finnes i kart og deretter konverteres til DOPA av tyrosinases8,9. På grunn av dens interessante biokjemiske egenskaper, har DOPA blitt brukt i en rekke applikasjoner. Gruppen dihydroxyl i DOPA er kjemisk utsatt for oksidasjon aminosyren omdannes lett til L-dopaquinone, en forløper til melanins. På grunn av sin høye electrofilia, har L-dopaquinone og dets derivater blitt brukt for crosslinking og Bøyning med thiols og aminer10,11,12,13. 1,2-quinones kan også fungere som en diene for sykloaddisjonsreaksjoner og har vært brukt i bioconjugation av belastning forfremmet oksidasjon-kontrollerte cyclooctyne-1,2-quinone (SPOCQ) cycloaddition14. I tillegg gruppen dihydroxyl kan chelate metall ioner som Fe3 + og Cu2 +og proteiner som inneholder DOPA har vært benyttet for narkotika-leveranser og metall ion sensing15,16.
DOPA har vært genetisk innlemmet i proteiner ved hjelp av en ortogonale aminoacyl-tRNA (aa-tRNA) og aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS) par17 og brukt for protein bøyning og crosslinking10,11, 12,13. Eksperimentelle resultater og protokoller for genetisk inkorporering av DOPA biosynthesized fra billige Start materialer og dens søknadene å bioconjugation beskrives i denne rapporten. DOPA er biosynthesized bruker en TPL og starter fra catechol, pyruvate, og ammoniakk i Escherichia coli. Biosynthesized DOPA er direkte tatt inn proteiner ved å uttrykke et utviklet aa-tRNA og aaRS par for DOPA. I tillegg blir biosynthesized protein inneholder DOPA site-specifically bøyd med fluorescerende sonde og krysskoblet å produsere protein oligomers. Denne protokollen er nyttig for protein forskere, biosynthesize mutant proteiner som inneholder DOPA og bøy proteiner med biokjemiske sonder eller medisiner for industri og farmasøytiske.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokollen, er den biosyntesen og direkte innlemmelse av DOPA beskrevet. Bakteriell cellen som er brukt i denne metoden kan syntetisere en ekstra aminosyre og bruke den som en unaturlig byggeblokk for proteinsyntese. Genetisk inkorporering av unaturlig aminosyrer har vært en viktig teknologi for utvikling av unaturlig organisme med en utvidet genetiske koden. Men denne metoden er teknisk ufullstendig og endres for å forbedre innlemmelse effektiviteten og redusere forstyrrelsene endogene oversettelse systemer. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble støttet av den globale Frontier Research Program (NRF-2015M3A6A8065833), og den grunnleggende Science Research Program (2018R1A6A1A03024940) gjennom de National Research Foundation av Korea (NRF) finansiert av Korea regjeringen.
Materials
| 1. Plasmid Construction | |||
| Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG | optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
| Plasmid pEvol-DHPRS2 | 1. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of l-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018). | ||
| DH10β | Invitrogen | C6400-03 | Expression Host |
| Plasmid Mini-prep kit | Nucleogen | 5112 | 200/pack |
| Agarose | Intron biotechnology | 32034 | 500 g |
| Ethidium bromide | Alfa Aesar | L07482 | 1 g |
| LB Broth | BD Difco | 244620 | 500 g |
| 2. Culture preparation | |||
| 2.1) Electroporation | |||
| Micro pulser | BIO-RAD | 165-2100 | |
| Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50 |
| Ampicillin Sodium | Wako | 018-10372 | 25 g |
| Chloramphenicol | Alfa Aesar | B20841 | 25 g |
| Agar | SAMCHUN | 214230 | 500 g |
| SOC medium | Sigma | S1797 | 100 mL |
| 3. Expression and Purification of GFP-E90DOPA by biosynthetic system | |||
| 3.1 Expression of GFP-E90DOPA by biosynthetic system | |||
| L(+)-Arabinose, 99% | Acros | 104981000 | 100 g |
| Pyrocatechol, 99% | SAMCHUN | P1387 | 25 g |
| Ammonium sulfate, 99% | SAMCHUN | A0943 | 500 g |
| pyruvic acid, 98% | Alfa Aesar | A13875 | 100 g |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous, 99% | SAMCHUN | S0891 | 1 kg |
| Potassium phophate, monobasic, 99% | SAMCHUN | P1127 | 1 kg |
| Magnesium sulfate, anhydrous, 99% | SAMCHUN | M0146 | 1 kg |
| D(+)-Glucose, anhydrous, 99% | SAMCHUN | D0092 | 500 g |
| Glycerol, 99% | SAMCHUN | G0269 | 1 kg |
| Trace metal mix a5 with co | Sigma | 92949 | 25 mL |
| L-Proline, 99% | SAMCHUN | P1257 | 25 g |
| L-Phenylalanine, 98.5% | SAMCHUN | P1982 | 25 g |
| L-Tryptophane | JUNSEI | 49550-0310 | 25 g |
| L-Arginine, 98% | SAMCHUN | A1149 | 25 g |
| L-Glutamine, 98% | JUNSEI | 27340-0310 | 25 g |
| L-Asparagine monohydrate, 99% | SAMCHUN | A1198 | 25 g |
| L-Methionine | JUNSEI | 73190-0410 | 25 g |
| L-Histidine hydrochloride monohydrate, 99% | SAMCHUN | H0604 | 25 g |
| L-Threonine, 99% | SAMCHUN | T2938 | 25 g |
| L-Leucine | JUNSEI | 87070-0310 | 25 g |
| Glycine, 99% | SAMCHUN | G0286 | 25 g |
| L-Glutamic acid, 99% | SAMCHUN | G0233 | 25 g |
| L-Alanine, 99% | SAMCHUN | A1543 | 25 g |
| L-Isoleucine, 99% | SAMCHUN | I1049 | 25 g |
| L-Valine, 99% | SAMCHUN | V0088 | 25 g |
| L-Serine | SAMCHUN | S2447 | 25 g |
| L-Aspartic acid | SAMCHUN | A1205 | 25 g |
| L-Lysine monohydrochloride, 99% | SAMCHUN | L0592 | 25 g |
| 3.2 Cell lysis | |||
| Imidazole, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1kg |
| Sodium phosphate monobasic, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1 kg |
| Sodium Chloride, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1 kg |
| Ultrasonic Processor – 150 microliters to 150 milliliters | SONIC & MATERIALS | VCX130 | |
| 3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography | |||
| Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | 25 mL |
| Polypropylene column | QIAGEN | 34924 | 50/pack, 1 mL capacity |
| 4. Oligomerization of Purified GFP-E90DOPA | |||
| Sodium periodate, 99.8& | Acros | 419610050 | 5 g |
| 5. Conjugation of GFP-E90DOPA with an Alkyne Probe by Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne–1,2-Quinone Cycloaddition (SPOCQ) | |||
| Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1mg |
| 6. Purification of Labeled GFP | |||
| Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters | MILLIPORE | UFC500396 | 96/pack, 500ul capacity |
| 7. SDS-PAGE Analysis and Fluorescence Gel Scanning | |||
| 1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 % | Sigma | 10708984001 | 10 g |
| NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X | Thermofisher | NP0007 | 10 mL |
| MES running buffer | Thermofisher | NP0002 | 500 mL |
| Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels | Thermofisher | NO0321 | 12 well |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25 g |
| G:BOX Chemi Fluorescent & Chemiluminescent Imaging System | Syngene | G BOX Chemi XT4 | |
| 8. MALDI-TOF MS analysis by Trypsin Digestion | |||
| 8.1 Preparation of the digested peptide sample by trypsin digestion | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500 g |
| Hydrochloric acid, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500 mL |
| Dodecyl sulfate sodium salt, 85% | SAMCHUN | D1070 | 250 g |
| Iodoacetamide | Sigma | I6125 | 5 g |
| Trypsin Protease, MS Grade | Thermofisher | 90057 | 5 x 20 µg/pack |
| C-18 spin columns | Thermofisher | 89870 | 25/pack, 200 µL capacity |
| 8.2 Analysis of the digested peptide by MALDI-TOF | |||
| Acetonitirile, 99.5% | SAMCHUN | A0125 | 500 mL |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma | C2020 | 10 g |
| Trifluoroacetic acid, 99% | SAMCHUN | T1666 | 100 g |
| MTP 384 target plate ground steel BC targets | Bruker | 8280784 | |
| Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker |
Referências
- Nagatsu, T., Levitt, M., Udenfriend, S. Tyrosine hydroxylase: The initial step in norepinephrine biosynthesis. Journal of Biological Chemistry. 239, 2910-2917 (1964).
- Pinder, R. M. Possible dopamine derivatives capable of crossing the blood-brain barrier in relation to parkinsonism. Nature. 228 (5269), 358 (1970).
- Waite, J. H., Tanzer, M. L. Polyphenolic substance of mytilus edulis: novel adhesive containing L-DOPA and hydroxyproline. Science. 212 (4498), 1038-1040 (1981).
- Lee, H., Scherer, N. F., Messersmith, P. B. Single-molecule mechanics of mussel adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 12999-13003 (2006).
- Papov, V. V., Diamond, T. V., Biemann, K., Waite, J. H. Hydroxyarginine-containing polyphenolic proteins in the adhesive plaques of the marine mussel Mytilus edulis. Journal of Biological Chemistry. 270 (34), 20183-20192 (1995).
- Waite, J. H., Qin, X. Polyphosphoprotein from the adhesive pads of Mytilus edulis. Bioquímica. 40 (9), 2887-2893 (2001).
- Nicklisch, S. C., Waite, J. H. Mini-review: The role of redox in DOPA-mediated marine adhesion. Biofouling. 28 (8), 865-877 (2012).
- Silverman, H. G., Roberto, F. Understanding marine mussel adhesion. Marine Biotechnology. 9 (6), 661-681 (2007).
- Lee, B. P., Messersmith, P. B., Israelachvili, J. N., Waite, J. H. Mussel-inspired adhesives and coatings. Annual Review of Materials Research. 41, 99-132 (2011).
- Umeda, A., Thibodeux, G. N., Zhu, J., Lee, Y., Zhang, Z. J. Site-specific protein cross-linking with genetically incorporated 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine. ChemBioChem. 10 (8), 1302-1304 (2009).
- Umeda, A., Thibodeux, G. N., Moncivais, K., Jiang, F., Zhang, Z. J. A versatile approach to transform low-affinity peptides into protein probes with cotranslationally expressed chemical cross-linker. Analytical Biochemistry. 405 (1), 82-88 (2010).
- Xu, J., Tack, D., Hughes, R. A., Ellington, A. D., Gray, J. J. Structure-based non-canonical amino acid design to covalently crosslink an antibody-antigen complex. Journal of Structural Biology. 185 (2), 215-222 (2014).
- Burdine, L., Gillette, T. G., Lin, H. J., Kodadek, T. Periodate-triggered cross-linking of DOPA-containing peptide-protein complexes. Journal of the American Chemical Society. 126 (37), 11442-11443 (2004).
- Borrmann, E., et al. Strain-promoted oxidation-controlled cyclooctyne-1,2-quinone cycloaddition (SPOCQ) for fast and activatable protein conjugation. Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 257-261 (2015).
- Ayyadurai, N., et al. Development of a selective, sensitive, and reversible biosensor by the genetic incorporation of a metal-binding site into green fluorescent protein. Angewandte Chemie International Edition. 50 (29), 6534-6537 (2011).
- Kim, B. J., Cheong, H., Hwang, B. H., Cha, H. J. Mussel-inspired protein nanoparticles containing iron(III)-DOPA complexes for pH-responsive drug delivery. Angewandte Chemie International Edition. 54 (25), 7318-7322 (2015).
- Alfonta, L., Zhang, Z., Uryu, S., Loo, J. A., Schultz, P. G. Site-specific incorporation of a redox-active amino acid into proteins. Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14662-14663 (2003).
- Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chemical Communications. 54 (24), 3002-3005 (2018).
- Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
- Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41 (1), 207-234 (2005).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Jang, S., Sachin, K., Lee, H. J., Kim, D. W., Lee, H. S. Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis. Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2256-2261 (2012).
- Gobom, J., et al. Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid affinity sample preparation. A protocol for MALDI-MS peptide analysis in proteomics. Analytical Chemistry. 73 (3), 434-438 (2001).
- Mukai, T., et al. Highly reproductive Escherichia coli cells with no specific assignment to the UAG codon. Scientific Reports. 5, 9699 (2015).
- Lajoie, M. J., et al. Genomically recoded organisms expand biological functions. Science. 342 (6156), 357-360 (2013).
- Bryson, D. I., et al. Continuous directed evolution of aminoacyl-tRNA synthetases. Nature Chemical Biology. 13 (12), 1253-1260 (2017).
- Guo, J., Melancon, C. E., Lee, H. S., Groff, D., Schultz, P. G. Evolution of amber suppressor tRNAs for efficient bacterial production of proteins containing nonnatural amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 48 (48), 9148-9151 (2009).
- Lee, S., et al. A facile strategy for selective phosphoserine incorporation in histones. Angewandte Chemie International Edition. 52 (22), 5771-5775 (2013).
- Neumann, H., Wang, K., Davis, L., Garcia-Alai, M., Chin, J. W. Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome. Nature. 464 (7287), 441-444 (2010).
- Lang, K., Chin, J. W. Bioorthogonal reactions for labeling proteins. ACS Chemical Biology. 9 (1), 16-20 (2014).
- Lang, K., Chin, J. W. Cellular Incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
- Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angewandte Chemie International Edition. 50 (17), 3878-3881 (2011).
- Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes. Journal of the American Chemical Society. 134 (6), 2898-2901 (2012).
