Aquí, presentamos un protocolo para la incorporación genética de L-dopa biosintetizada a partir de materiales partidos simples y su aplicación a la conjugación de proteínas.
L-dopa (DOPA) es un aminoácido encontrado en la biosíntesis de catecolaminas en animales y plantas. Debido a sus propiedades bioquímicas, el aminoácido tiene múltiples usos en aplicaciones bioquímicas. Este informe describe un protocolo para la incorporación genética de biosynthesized DOPA y su aplicación a la conjugación de proteínas. El DOPA es biosintetizada a partir de una tirosina fenol-liasa (TPL) de catecol, piruvato y amoníaco, y el aminoácido se incorpora directamente a las proteínas por el método de incorporación genética mediante un evolucionado aminoacil-tRNA y aminoacil-tRNA sintetasa par. Este sistema de incorporación directa incorpora eficientemente DOPA con poca incorporación de otros aminoácidos naturales y con mejor rendimiento de proteína que el sistema anterior de la incorporación genética de DOPA. Conjugación de proteínas con proteínas que contienen el DOPA es eficiente y site-specific y demuestra su utilidad para diversas aplicaciones. Este protocolo proporciona a los científicos de la proteína con los procedimientos detallados para la eficiente biosíntesis de proteínas del mutante que contiene DOPA en sitios deseados y su conjugación para aplicaciones industriales y farmacéuticas.
DOPA es un aminoácido implicado en la biosíntesis de catecolaminas en animales y plantas. Este aminoácido es sintetizado de Tyr por tirosina hidroxilasa y oxígeno molecular (O2)1. Porque se DOPA es un precursor de la dopamina y puede penetrar la barrera hematoencefálica, se ha utilizado en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson2. DOPA también se encuentra en proteínas de la adherencia del mejillón (mapas), que son responsables de las propiedades adhesivas de los mejillones en condiciones mojadas3,4,5,6,7. Tyr se codifica inicialmente en las posiciones donde DOPA se encuentra en los mapas y luego se convierte en DOPA tyrosinases8,9. Debido a sus interesantes propiedades bioquímicas, la DOPA se ha utilizado en una variedad de aplicaciones. El grupo dihydroxyl de DOPA es químicamente propenso a la oxidación, y el aminoácido se convierte fácilmente en L-dopaquinona, un precursor de la melanina. Debido a su alta electrophilicity, L-dopaquinona y sus derivados se han utilizado para la reticulación y la conjugación con tioles y aminas10,11,12,13. 1, 2-quinonas también pueden funcionar como un dieno de reacciones de cicloadición y han utilizado para bioconjugation promovido de tensión controlada por oxidación cyclooctyne-1,2-quinona (SPOCQ) cicloadición14. Además, el grupo dihydroxyl puede quelar iones metálicos como el Fe3 + y Cu2 +, y las proteínas que contienen DOPA se han utilizado para el suministro de medicamentos e iones metálicos detección15,16.
DOPA ha sido genéticamente incorporado en las proteínas mediante una ortogonal Aminoacil-ARNt (aa-ARNt) y el aminoacil-tRNA sintetasa (aaRS) par17 y utiliza para proteína Conjugación y reticulación10,11, 12,13. En este informe, se describen los resultados experimentales y protocolos para la incorporación genética de DOPA biosintetizada a partir de materias primas baratas y sus aplicaciones a bioconjugation. El DOPA es biosynthesized usando una TPL y a partir de catecol, piruvato y amoníaco en Escherichia coli. Biosynthesized DOPA se incorpora directamente en proteínas expresando un par aa-tRNA y aaRS evolucionado para DOPA. Además, la proteína biosynthesized con DOPA site-specifically se conjuga con una sonda fluorescente y reticulado para producir oligomeros de proteína. Este Protocolo será útil para los científicos de la proteína, para sintetizar las proteínas mutantes con DOPA y conjugar las proteínas con sondas bioquímicas o drogas para aplicaciones industriales y farmacéuticas.
En este protocolo, se describen la biosíntesis y la incorporación directa de DOPA. La célula bacteriana utilizada en este método puede sintetizar un aminoácido adicional y utilizarlo como un bloque de construcción natural para la síntesis de proteínas. La incorporación genética de aminoácidos no naturales ha sido una tecnología clave para el desarrollo del organismo artificial con un código genético expandido. Sin embargo, este método ha sido técnicamente incompleta y se está modificando para mejorar la …
The authors have nothing to disclose.
Esta investigación fue apoyada por el programa Global de investigación de frontera (NRF-2015M3A6A8065833), y la ciencia investigación programa básico (2018R1A6A1A03024940) a través de la Fundación de investigación nacional de Corea (NRF) financiado por el gobierno de Corea.
1. Plasmid Construction | |||
Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG | optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
Plasmid pEvol-DHPRS2 | 1. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of l-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018). | ||
DH10β | Invitrogen | C6400-03 | Expression Host |
Plasmid Mini-prep kit | Nucleogen | 5112 | 200/pack |
Agarose | Intron biotechnology | 32034 | 500 g |
Ethidium bromide | Alfa Aesar | L07482 | 1 g |
LB Broth | BD Difco | 244620 | 500 g |
2. Culture preparation | |||
2.1) Electroporation | |||
Micro pulser | BIO-RAD | 165-2100 | |
Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50 |
Ampicillin Sodium | Wako | 018-10372 | 25 g |
Chloramphenicol | Alfa Aesar | B20841 | 25 g |
Agar | SAMCHUN | 214230 | 500 g |
SOC medium | Sigma | S1797 | 100 mL |
3. Expression and Purification of GFP-E90DOPA by biosynthetic system | |||
3.1 Expression of GFP-E90DOPA by biosynthetic system | |||
L(+)-Arabinose, 99% | Acros | 104981000 | 100 g |
Pyrocatechol, 99% | SAMCHUN | P1387 | 25 g |
Ammonium sulfate, 99% | SAMCHUN | A0943 | 500 g |
pyruvic acid, 98% | Alfa Aesar | A13875 | 100 g |
Sodium phosphate dibasic, anhydrous, 99% | SAMCHUN | S0891 | 1 kg |
Potassium phophate, monobasic, 99% | SAMCHUN | P1127 | 1 kg |
Magnesium sulfate, anhydrous, 99% | SAMCHUN | M0146 | 1 kg |
D(+)-Glucose, anhydrous, 99% | SAMCHUN | D0092 | 500 g |
Glycerol, 99% | SAMCHUN | G0269 | 1 kg |
Trace metal mix a5 with co | Sigma | 92949 | 25 mL |
L-Proline, 99% | SAMCHUN | P1257 | 25 g |
L-Phenylalanine, 98.5% | SAMCHUN | P1982 | 25 g |
L-Tryptophane | JUNSEI | 49550-0310 | 25 g |
L-Arginine, 98% | SAMCHUN | A1149 | 25 g |
L-Glutamine, 98% | JUNSEI | 27340-0310 | 25 g |
L-Asparagine monohydrate, 99% | SAMCHUN | A1198 | 25 g |
L-Methionine | JUNSEI | 73190-0410 | 25 g |
L-Histidine hydrochloride monohydrate, 99% | SAMCHUN | H0604 | 25 g |
L-Threonine, 99% | SAMCHUN | T2938 | 25 g |
L-Leucine | JUNSEI | 87070-0310 | 25 g |
Glycine, 99% | SAMCHUN | G0286 | 25 g |
L-Glutamic acid, 99% | SAMCHUN | G0233 | 25 g |
L-Alanine, 99% | SAMCHUN | A1543 | 25 g |
L-Isoleucine, 99% | SAMCHUN | I1049 | 25 g |
L-Valine, 99% | SAMCHUN | V0088 | 25 g |
L-Serine | SAMCHUN | S2447 | 25 g |
L-Aspartic acid | SAMCHUN | A1205 | 25 g |
L-Lysine monohydrochloride, 99% | SAMCHUN | L0592 | 25 g |
3.2 Cell lysis | |||
Imidazole, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1kg |
Sodium phosphate monobasic, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1 kg |
Sodium Chloride, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1 kg |
Ultrasonic Processor – 150 microliters to 150 milliliters | SONIC & MATERIALS | VCX130 | |
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography | |||
Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | 25 mL |
Polypropylene column | QIAGEN | 34924 | 50/pack, 1 mL capacity |
4. Oligomerization of Purified GFP-E90DOPA | |||
Sodium periodate, 99.8& | Acros | 419610050 | 5 g |
5. Conjugation of GFP-E90DOPA with an Alkyne Probe by Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne–1,2-Quinone Cycloaddition (SPOCQ) | |||
Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1mg |
6. Purification of Labeled GFP | |||
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters | MILLIPORE | UFC500396 | 96/pack, 500ul capacity |
7. SDS-PAGE Analysis and Fluorescence Gel Scanning | |||
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 % | Sigma | 10708984001 | 10 g |
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X | Thermofisher | NP0007 | 10 mL |
MES running buffer | Thermofisher | NP0002 | 500 mL |
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels | Thermofisher | NO0321 | 12 well |
Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25 g |
G:BOX Chemi Fluorescent & Chemiluminescent Imaging System | Syngene | G BOX Chemi XT4 | |
8. MALDI-TOF MS analysis by Trypsin Digestion | |||
8.1 Preparation of the digested peptide sample by trypsin digestion | |||
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500 g |
Hydrochloric acid, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500 mL |
Dodecyl sulfate sodium salt, 85% | SAMCHUN | D1070 | 250 g |
Iodoacetamide | Sigma | I6125 | 5 g |
Trypsin Protease, MS Grade | Thermofisher | 90057 | 5 x 20 µg/pack |
C-18 spin columns | Thermofisher | 89870 | 25/pack, 200 µL capacity |
8.2 Analysis of the digested peptide by MALDI-TOF | |||
Acetonitirile, 99.5% | SAMCHUN | A0125 | 500 mL |
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma | C2020 | 10 g |
Trifluoroacetic acid, 99% | SAMCHUN | T1666 | 100 g |
MTP 384 target plate ground steel BC targets | Bruker | 8280784 | |
Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker |