Här presenterar vi ett protokoll för genetiska införlivandet av L-dihydroxifenylalanin biosyntetiseras från enkla utgångsmaterial och dess tillämpning på protein konjugation.
L-dihydroxifenylalanin (L-dopa) är en aminosyra som finns i biosyntesen av katekolaminer i djur och växter. På grund av dess särskilda biokemiska egenskaper har aminosyran flera användningsområden i biokemiska tillämpningar. Denna rapport beskriver ett protokoll för genetiska införlivandet av biosyntetiseras DOPA och dess tillämpning på protein konjugation. L-dopa är biosyntetiseras av en tyrosin fenol-lyasen (TPL) från katekol, pyruvat och ammoniak, och aminosyran är direkt införlivad med proteiner av metoden genetiska inkorporering med hjälp av en utvecklad aminoacyl-tRNA och aminoacyl-tRNA Synthetasen par. Detta direkta inkorporering system inlemmar effektivt DOPA med lite införlivandet av andra naturliga aminosyror och med bättre protein avkastning än det tidigare genetiska inkorporering systemet för DOPA. Protein konjugering med DOPA-innehållande proteiner är effektiv och platsspecifika och visar dess användbarhet för olika applikationer. Detta protokoll ger protein forskare med detaljerade förfaranden för effektiv biosyntesen av muterade proteiner som innehåller DOPA på önskad webbplatser och deras konjugation för industriella och farmaceutiska tillämpningar.
L-dopa är en aminosyra som är involverad i biosyntesen av katekolaminer i djur och växter. Denna aminosyra är syntetiserade från Tyr av tyrosin hydroxylas och molekylärt syre (O2)1. Eftersom L-dopa är en förelöpare till dopamin och kan genomsyra den blood – brain barriären, har det använts för behandling av Parkinsons sjukdom2. DOPA finns även i mussla vidhäftning proteiner (MAPs), som ansvarar för de vidhäftande egenskaperna av musslor i våta förhållanden3,4,5,6,7. Tyr är ursprungligen kodad på positioner där DOPA finns i kartor och omvandlas sedan till DOPA med tyrosinases8,9. På grund av dess intressanta biokemiska egenskaper, har DOPA använts i en mängd tillämpningar. Gruppen dihydroxyl av DOPA är kemiskt benägna att oxidation och aminosyran omvandlas enkelt till L-dopaquinone, en föregångare av melanins. På grund av dess höga elektrofilicitet, har L-dopaquinone och dess derivat använts för crosslinking och konjugation med tioler och aminer10,11,12,13. 1,2-kinoner kan också fungera som en Dien för cykloadditionen reaktioner och har använts för bioconjugation av stam-främjas för oxidation-kontrollerade cyclooctyne-1,2-quinone (SPOCQ) cykloadditionen14. Dessutom gruppen dihydroxyl kan kelat metalljoner såsom Fe3 + och Cu2 +, och proteiner som innehåller DOPA har utnyttjats för drogen leverans och metall Jon avkänning15,16.
L-dopa har genetiskt införlivas proteiner med hjälp av en ortogonal aminoacyl-tRNA (aa-tRNA) och aminoacyl-tRNA Synthetasen (aaRS) par17 och används för protein konjugering och crosslinking10,det11, 12,13. I denna rapport beskrivs experimentella resultat och protokoll för genetiska införlivandet av DOPA biosyntetiseras från billiga utgångsmaterial och dess tillämpningar till bioconjugation. L-dopa är biosyntetiseras använder en TPL och start från katekol, pyruvat och ammoniak i Escherichia coli. Biosyntetiseras DOPA är direkt införlivat proteiner genom att uttrycka en utvecklad aa-tRNA och aaRS par för DOPA. Dessutom är proteinet biosyntetiseras innehållande DOPA anläggningsvis konjugerat med en fluorescerande sond och tvärbundna att producera protein oligomerer. Detta protokoll kommer att vara användbart för protein forskare, att biosynthesize muterade proteiner som innehåller DOPA och konjugat proteinerna med biokemiska sonder eller läkemedel för industriella och farmaceutiska tillämpningar.
I detta protokoll beskrivs biosyntes och direkt införlivande av DOPA. Den bakteriella cellen som används i den här metoden kan syntetisera en ytterligare aminosyra och använda den som en onaturlig byggsten för proteinsyntesen. Genetiska införlivandet av onaturliga aminosyror har varit en nyckel-teknologi för utveckling av onaturliga organism med en utökad genetiska kod. Men denna metod har varit tekniskt ofullständig och håller på att ändras för att förbättra införlivandet effektiviteten och minimera stö…
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöddes av globala Frontier forskningsprogrammet (NRF-2015M3A6A8065833), och grundläggande vetenskap forskningsprogrammet (2018R1A6A1A03024940) genom den nationella Research Foundation i Korea (NRF) finansieras av Korea regeringen.
1. Plasmid Construction | |||
Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG | optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
Plasmid pEvol-DHPRS2 | 1. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of l-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018). | ||
DH10β | Invitrogen | C6400-03 | Expression Host |
Plasmid Mini-prep kit | Nucleogen | 5112 | 200/pack |
Agarose | Intron biotechnology | 32034 | 500 g |
Ethidium bromide | Alfa Aesar | L07482 | 1 g |
LB Broth | BD Difco | 244620 | 500 g |
2. Culture preparation | |||
2.1) Electroporation | |||
Micro pulser | BIO-RAD | 165-2100 | |
Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50 |
Ampicillin Sodium | Wako | 018-10372 | 25 g |
Chloramphenicol | Alfa Aesar | B20841 | 25 g |
Agar | SAMCHUN | 214230 | 500 g |
SOC medium | Sigma | S1797 | 100 mL |
3. Expression and Purification of GFP-E90DOPA by biosynthetic system | |||
3.1 Expression of GFP-E90DOPA by biosynthetic system | |||
L(+)-Arabinose, 99% | Acros | 104981000 | 100 g |
Pyrocatechol, 99% | SAMCHUN | P1387 | 25 g |
Ammonium sulfate, 99% | SAMCHUN | A0943 | 500 g |
pyruvic acid, 98% | Alfa Aesar | A13875 | 100 g |
Sodium phosphate dibasic, anhydrous, 99% | SAMCHUN | S0891 | 1 kg |
Potassium phophate, monobasic, 99% | SAMCHUN | P1127 | 1 kg |
Magnesium sulfate, anhydrous, 99% | SAMCHUN | M0146 | 1 kg |
D(+)-Glucose, anhydrous, 99% | SAMCHUN | D0092 | 500 g |
Glycerol, 99% | SAMCHUN | G0269 | 1 kg |
Trace metal mix a5 with co | Sigma | 92949 | 25 mL |
L-Proline, 99% | SAMCHUN | P1257 | 25 g |
L-Phenylalanine, 98.5% | SAMCHUN | P1982 | 25 g |
L-Tryptophane | JUNSEI | 49550-0310 | 25 g |
L-Arginine, 98% | SAMCHUN | A1149 | 25 g |
L-Glutamine, 98% | JUNSEI | 27340-0310 | 25 g |
L-Asparagine monohydrate, 99% | SAMCHUN | A1198 | 25 g |
L-Methionine | JUNSEI | 73190-0410 | 25 g |
L-Histidine hydrochloride monohydrate, 99% | SAMCHUN | H0604 | 25 g |
L-Threonine, 99% | SAMCHUN | T2938 | 25 g |
L-Leucine | JUNSEI | 87070-0310 | 25 g |
Glycine, 99% | SAMCHUN | G0286 | 25 g |
L-Glutamic acid, 99% | SAMCHUN | G0233 | 25 g |
L-Alanine, 99% | SAMCHUN | A1543 | 25 g |
L-Isoleucine, 99% | SAMCHUN | I1049 | 25 g |
L-Valine, 99% | SAMCHUN | V0088 | 25 g |
L-Serine | SAMCHUN | S2447 | 25 g |
L-Aspartic acid | SAMCHUN | A1205 | 25 g |
L-Lysine monohydrochloride, 99% | SAMCHUN | L0592 | 25 g |
3.2 Cell lysis | |||
Imidazole, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1kg |
Sodium phosphate monobasic, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1 kg |
Sodium Chloride, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1 kg |
Ultrasonic Processor – 150 microliters to 150 milliliters | SONIC & MATERIALS | VCX130 | |
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography | |||
Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | 25 mL |
Polypropylene column | QIAGEN | 34924 | 50/pack, 1 mL capacity |
4. Oligomerization of Purified GFP-E90DOPA | |||
Sodium periodate, 99.8& | Acros | 419610050 | 5 g |
5. Conjugation of GFP-E90DOPA with an Alkyne Probe by Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne–1,2-Quinone Cycloaddition (SPOCQ) | |||
Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1mg |
6. Purification of Labeled GFP | |||
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters | MILLIPORE | UFC500396 | 96/pack, 500ul capacity |
7. SDS-PAGE Analysis and Fluorescence Gel Scanning | |||
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 % | Sigma | 10708984001 | 10 g |
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X | Thermofisher | NP0007 | 10 mL |
MES running buffer | Thermofisher | NP0002 | 500 mL |
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels | Thermofisher | NO0321 | 12 well |
Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25 g |
G:BOX Chemi Fluorescent & Chemiluminescent Imaging System | Syngene | G BOX Chemi XT4 | |
8. MALDI-TOF MS analysis by Trypsin Digestion | |||
8.1 Preparation of the digested peptide sample by trypsin digestion | |||
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500 g |
Hydrochloric acid, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500 mL |
Dodecyl sulfate sodium salt, 85% | SAMCHUN | D1070 | 250 g |
Iodoacetamide | Sigma | I6125 | 5 g |
Trypsin Protease, MS Grade | Thermofisher | 90057 | 5 x 20 µg/pack |
C-18 spin columns | Thermofisher | 89870 | 25/pack, 200 µL capacity |
8.2 Analysis of the digested peptide by MALDI-TOF | |||
Acetonitirile, 99.5% | SAMCHUN | A0125 | 500 mL |
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma | C2020 | 10 g |
Trifluoroacetic acid, 99% | SAMCHUN | T1666 | 100 g |
MTP 384 target plate ground steel BC targets | Bruker | 8280784 | |
Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker |