Medição de consumo de oxigênio mitocondrial hepática e cinética de vazamento de protões para estimar a respiração mitocondrial no gado leiteiro de Holstein

Summary

Aqui, nós compartilhamos métodos de medição do consumo de oxigênio mitocondrial, um definição conceito de nutricional energética e vazamento de prótons, a principal causa de ineficiência na geração mitocondrial de ATP. Estes resultados podem representam 30% da energia perdida na utilização de nutrientes para ajudar a avaliar a função mitocondrial.

Abstract

Consumo de oxigênio, prótons força (PMF) e vazamento de próton são medidas da respiração mitocondrial, ou quão bem as mitocôndrias são capazes de converter o NADH e DANIII em ATP. Desde que as mitocôndrias são também o local principal para o uso de oxigênio e nutriente oxidação de dióxido de carbono e água, quanto à eficácia, eles usam o oxigênio e produzem ATP diretamente se relaciona com a eficiência do metabolismo de nutrientes, as necessidades de nutrientes do animal, e saúde do animal. A finalidade desse método é examinar a respiração mitocondrial, que pode ser usada para examinar os efeitos das diferentes drogas, dietas e os efeitos ambientais sobre o metabolismo mitocondrial. Os resultados incluem o consumo de oxigênio, medido como respiração dependente de próton (estado 3) e respiração dependente do vazamento próton (estado 4). A relação da respiração estado 4 3 / estado é definida como índice de controlo respiratório (ICR) e pode representar a eficiência energética mitocondrial. Vazamento de próton mitocondrial é um processo que permite a dissipação do potencial de membrana mitocondrial (MMP) desacoplamento fosforilação oxidativa do ADP, diminuindo a eficiência da síntese de ATP. Oxigênio e TRMP + eletrodos sensíveis com substratos mitocondriais e inibidores da cadeia de transporte de elétrons são usados para medir o estado 3 e 4 do estado respiração, membrana mitocondrial PMF (ou o potencial para produzir ATP) e vazamento de próton. Limitações para este método são que o tecido do fígado deve ser tão fresco quanto possível e todas as biópsias e ensaios devem ser realizados em menos de 10 h. Isso limita o número de amostras que podem ser recolhidos e tratados por uma única pessoa de um dia para aproximadamente 5. No entanto, é necessário apenas 1 g de tecido hepático, então em grandes animais, como gado leiteiro, a quantidade de amostra necessária é pequena em relação ao tamanho do fígado e há pouco tempo de recuperação necessário.

Introduction

As mitocôndrias são muito sensíveis ao estresse e seu ambiente celular pode contribuir para uma ampla variedade de doenças metabólicas. Consumo de oxigênio e vazamento de prótons na mitocôndria são indicadores de saúde de mitocôndrias. Os métodos descritos neste papel estimativa mitocondrial eficiência de energia usando RCR baseiam no consumo de oxigênio, com e sem vazamento de próton. Estes resultados podem representam 30% da energia perdida na utilização de nutrientes¹. Mudanças no consumo e próton vazamento de oxigênio podem identificar a disfunção mitocondrial, o que contribui para doenças metabólicas e resulta em eficiência energética dimi....

Protocol

Todos os métodos, protocolo e estudos aqui descritos foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade da Califórnia, Davis.

1. a obtenção de uma biópsia do fígado de uma vaca leiteira de Holstein

Nota: Uma biópsia do fígado deve ser realizada por um veterinário licenciado. Biópsias do fígado podem ser executadas no site onde se situam as vacas leiteiro. Vacas leiteiras em lactação podem continuar a ser ordenhada normalmente e leite não precisa ser retirada da fonte de alimentos antes ou após o procedimento. É recomendável que pelo menos 4 pessoas são necessários ....

Results

Resultados positivos, mostrando a cinética de vazamento RCR e prótons são mostrados na tabela 1 e Figura 15, respectivamente. No presente estudo⁷, RCR e proteína vazamento cinética foram medidos em vacas leiteiras Holstein em 70 dias no leite depois que as vacas tinham sido alimentadas 1 dos 5 níveis diferentes de Cu, Zn e Mn por 28 dias. Estado 4, respiração de vazamento-dependente de próton máximo, tinha uma tendênci.......

Discussion

O ponto mais crítico no protocolo é obter uma amostra representativa de tecido hepático e começando o isolamento da mitocôndria, logo que possível após a biópsia. Variação nas medições de respiração é baixa (tabela 1) devido a um tempo de transporte curto de vaca para laboratório. Para reduzir o tempo de transporte, foi instituído um pequeno laboratório no escritório da leiteria, e amostras de fígado foram levadas para o laboratório de escritório como cada uma foi coletada para que as mitocôndrias foram .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biópsia hepática
Equipamento
Instrumento de biópsia de fígado bovino Schackelford-Courtney	Sontec Instruments Englewood CO	1103-904
Sutura	Fisher Scientific	19-037-516
Agulhas de sutura	NA	NA	Incluídas com Sutura
Bisturis	Sigma - Aldrich	S2896 / S2646	# para cabo e lâminas
Toalhas de cirurgia	Fisher Scientific	50-129-6667
Tubos de falcão 50 mL	Fisher Scientific	14-432-22
Pinças	Sigma - Aldrich	Z168750
Seringas de 50 mL	Fisher Scientific	22-314387
Agulhas de injeção (22, 2 1/2)	VWR	MJ8881-200342
Cow halter	Tractor Supply Co.
Algodão	Fisher Scientific	14-959-102
quadrados de gaze de algodão (4x4)	Fisher Scientific	22-246069
Tesoura médica	Sigma - Aldrich	Z265969
Chemicals
Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow			Fornecido por Vacina
		Clostridia	Fornecida pelo Veterinário
Antibióticos de biópsia hepática excenel 2 cc/100 lbs por 3 dias			Fornecido pelo Veterinário
Providone Scrub	Aspen Veteterinary Resources	21260221
Etanol 70%	Sigma - Aldrich	793213
Cloridrato de xilazina 100 mg/mL IV a 0,010-0,015 mg/kg peso			Fornecido pelo veterinário
2% de lidocaína HCl (10-15 mL)			Fornecido pelo veterinário
1 mg/kg IV injeção de flunixina meglumina			Fornecido pelo veterinário
Isolamento de mitocôndrias (fígado)
Equipamento
Frasco Wheaton 30 mL com um pilão de Teflon de 0,16 mm de folga	Fisher Scientific	02-911-527
Motor Homogeneizador	Cole Parmer	EW-04369-10
Sonda Homogeneizadora	Cole Parmer	EW-04468-22
Pipeta Automática (10 mL)	Cole Parmer	SK-21600-74
Copo (500 mL) com gelo	Fisher Scientific	FB100600
Microfuga refrigerada	Fisher Scientific	75-002-441EW3
Tubos de microfuga (1,5 mL)	Fisher Scientific	AM12400
ChemicalsKit de
ensaio de proteína de ácido bicinchonínico (BCA) (microplacas para leitor de placas)	abcam	ab102536
Sucrose	Sigma - Aldrich	S7903-1KG
Tris-HCl	Sigma - Aldrich	T1503-1KG
EDTA	Sigma - Aldrich	EDS-1KG
BSA (livre de ácidos graxos)	Sigma - Aldrich	A7030-50G
Manitol	Sigma - Aldrich	M4125-1KG
Água deionizada	Sigma - Aldrich	38796
Hepes	Sigma - Aldrich	H3375-500G
Use para criar meios de isolamento de mitocôndrias: 220 mM de manitol, 70 mM de sacarose, 20 mM de HEPES, 20 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA e 0,1% (p/v) de BSA livre de ácidos graxos  pH 7,4 a 4   C, durará 2 dias em geladeira
Consumo de oxigênio mitocondrial< / forte>
Equipamento< / forte>
Configuração do oxígrafo + eletrodo de oxigênio tipo Clark	Hansatech (PP Systems)	OXY1
	ADInstruments	MLE2001
Eletrodo de oxigênio tipo Clark	NA	NA
Autopipeta (1 mL)	Cole Parmer	SK-21600-70	Incluído com Oxy1
Pequena barra de agitação magnética	Micropipeta Fisher Scientific	14-513-95
(10 μ L)	Cole Parmer	SK-21600-60
medidor de pH	VWR
strong>Chemicals
KCl	Sigma - Aldrich	P9333-1KG
Hepes	Sigma - Aldrich	H3375-500G
KH2PO4	Sigma - Aldrich	P5655-1KG
MgCl2	Sigma - Aldrich	M1028-100ML
EGTA	Sigma - Aldrich	E3889-100G
Use para fazer meios de consumo de oxigênio mitocondrial: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes e 1 mM EGTA,  pH 7,4 a 30 ° C com 0,3% de rotenona BSA
(solução de 4 mM)	Sigma - Succinato	Aldrich R8875-5G
(solução de 1 M)	Sigma - Aldrich	S3674-250G
ADP (solução de 100 mM)	Sigma - Aldrich	A5285-1G
Oligomicina (solução de 8 μ g/mL em etanol)	Sigma - Aldrich	75351
FCCP	Sigma - Aldrich	C2920
Potencial de membrana mitocondrial e força motriz de prótons<
strong>Equipment
TPMP electrode	World Precision Instruments.	DRIREF-2
Chemicals-solutions não precisam ser frescas, mas precisam ser mantidas em um freezer entre as execuções
Malonate (solução de 0,1 mM)	Sigma - Aldrich	M1296
Oligomicina (8 μ g/mL em etanol), manter em freezer	Sigma - Aldrich	75351
Nigericin (80 ng/mL em etanol), manter em freezer	Sigma - Aldrich	N7143
FCCP	Sigma - Aldrich	C3920
TPMP	Sigma - Aldrich	T200
TPMP solução: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes e 1 mM EGTA,  pH 7,4 a 30 & C com BSA