Mesure d’oxygéne mitochondries du foie et la cinétique de fuite Proton pour estimer la Respiration mitochondriale chez les vaches laitières Holstein
Summary
Ici, nous partageons des méthodes pour mesurer la consommation d’oxygène mitochondriale, un concept définissant d’Energétique nutritionnelle et fuite de protons, la principale cause d’inefficacité dans la production mitochondriale de l’ATP. Ces résultats peuvent représentent 30 % de l’énergie perdue dans l’utilisation des nutriments pour aider à évaluer la fonction mitochondriale.
Abstract
La consommation d’oxygène, motif de proton force (CMR) et fuite de protons sont les mensurations de la respiration mitochondriale, ou comment bien les mitochondries sont en mesure de convertir NADH et FADH en ATP. Étant donné que les mitochondries sont également le principal site pour l’utilisation de l’oxygène et de nutriments oxydation de dioxyde de carbone et l’eau, l’efficacité avec laquelle ils utilisent de l’oxygène et produisent de l’ATP directement a trait à l’efficacité du métabolisme des nutriments, les besoins nutritionnels de l’animal, et santé de l’animal. Le but de cette méthode consiste à examiner la respiration mitochondriale, qui peut être utilisée pour examiner les effets des différents médicaments, régimes alimentaires et effets sur le métabolisme mitochondrial. Les résultats comprennent la consommation d’oxygène mesurée en respiration dépendante de proton (État 3) et la respiration de dépendant de fuite de proton (État 4). Le ratio de la respiration État 4 3 / Etat est défini comme rapport de contrôle respiratoire (RCR) et peut représenter efficacité énergétique mitochondriale. Fuite de protons mitochondriale est un procédé qui permet la dissipation du potentiel de membrane mitochondrial (MMP) par découplage de la phosphorylation oxydative d’ADP, diminution de l’efficacité de la synthèse d’ATP. Oxygène et TRMP + électrodes sensibles avec mitochondriales substrats et inhibiteurs de la chaîne de transport d’électrons sont utilisés pour mesurer l’État 3 et 4 de l’état respiratoire, membrane mitochondriale PMF (ou susceptibles de produire de l’ATP) et fuite de protons. Limitations de cette méthode sont que le tissu hépatique doit être aussi fraîche que possible et toutes les biopsies et les essais doivent être effectuées en moins de 10 h. Cela limite le nombre d’échantillons qui peuvent être collectées et traitées par une seule personne par jour à environ 5. Cependant, seulement 1 g de tissu hépatique est nécessaire, donc dans les grands animaux, tels que les vaches laitières, la quantité d’échantillon nécessaire est faible par rapport à la taille du foie et il y a peu temps de récupération nécessaire.
Introduction
Les mitochondries sont très sensibles au stress et leur environnement cellulaire peut contribuer à une grande variété de maladies métaboliques. Consommation d’oxygène et la fuite de protons dans les mitochondries sont des indicateurs de santé de mitochondries. Les méthodes décrites dans ce document estimation mitochondrial l’efficacité énergétique à l’aide de RCR basent sur la consommation d’oxygène avec et sans fuite de protons. Ces résultats peuvent représentent 30 % de l’énergie perdue dans l’utilisation des éléments nutritifs1. Changements dans la fuite de proton et de la consommation d’oxygène peuvent identifier un dysfonctionnement mitochondrial qui contribue aux maladies métaboliques et se traduit par une diminution de l’efficacité énergétique. Ces méthodes peuvent également être utilisées pour étudier l’effet des différents traitements sur la respiration mitochondriale. L’objectif général de mesurer la consommation d’oxygène mitochondriale et la cinétique de fuite de proton est d’évaluer la fonction mitochondriale et efficacité énergétique.
Dysfonctionnement mitochondrial hépatique a été associé à plusieurs maladies chez les vaches laitières. La capacité du métabolisme cellulaire pour basculer entre les carburants glucidiques et lipidiques, face à un déficit énergétique en début de lactation est influencée par le nombre et la fonction des mitochondries dans la cellule2. Défauts de la capacité des mitochondries pour s’adapter à une demande accrue d’énergie et de la β-oxydation accrue peuvent entraîner une accumulation de lipides intracellulaires associés à l’insulino-résistance et peuvent conduire à la formation de foie gras chez les vaches laitières de lactation précoce. Mitochondries, comme le site de production de corps cétoniques et utilisation, peuvent jouer un rôle clé dans le ketosis chez les vaches laitières3. Absence de mitochondries ou dysfonctionnement mitochondrial aura une incidence combustibles disponibles vers la périphérie et se reflétée des changements dans la consommation d’oxygène ou RCR.
Changements de consommation d’oxygène mitochondriale en réponse à l’inflammation. Poulets de chair âgés de sept jours ont été assignés au hasard à un groupe infecté par Eimeria maxima et un groupe de contrôle4. Poulets de chair qui ne subissent pas de défi de coccidiose avaient faible consommation d’oxygène due à la fuite de protons et RCR supérieur indiquant que les mitochondries du foie répondent à une stimulation immunitaire par fuite de protons croissante. Tout en fuite de protons et réactive production d’espèces oxygénées était autrefois considéré comme un signe de dysfonctionnement de la membrane mitochondriale et préjudiciable à l’efficacité énergétique, maintenant on sait qu’il est important pour l’importation de protéines et de calcium dans les mitochondries5 et pour la génération de chaleur1.
Fuite d’électrons de la chaine respiratoire rend les mitochondries sensibles à la production d’espèces réactives de l’oxygène et les dommages oxydatifs aux protéines de la membrane mitochondriale, lipides et l’ADN mitochondrial. Comme l’âge des mitochondries, des dommages peuvent s’accumuler en particulier d’ADNmt occasionne un autre dysfonctionnement du métabolisme mitochondrial6 et une plus grande susceptibilité de la vache à la maladie. Dans la pratique, de nombreux animaux d’élevage est nourris des niveaux élevés de suppléments tels que Cu, Zn et Mn pour stimuler la fonction antioxydante. Toutefois, nourrir des niveaux élevés de Cu, Zn et Mn diminue la production de lait et a augmenté la consommation d’oxygène due à proton fuite (respiration État 4)7.
Des recherches antérieures sur le rôle de la fonction mitochondriale dans l’efficacité énergétique chez les bovins a mis l’accent sur les changements dans la consommation d’oxygène mitochondriale et fuite de protons. Très peu d’études ont été publiées chez les vaches laitières et la plupart des papiers comparer l’efficacité de production sous la forme d’ingestion d’aliments résiduelle (DDR) à la fonction mitochondriale chez les bovins de boucherie. Variabilité de la respiration mitochondriale, les taux ont été examinés en mesurant l’État 3, 4 et RCR dans le foie des vaches Holstein en lactation et lactation boeuf vaches (Brangus, Angus et Hereford)8. Les chercheurs n’a pas trouvé aucune corrélation dans la respiration mitochondriale avec croissance ou traite des traits pour les bovins, mais n’a signalé une corrélation entre la respiration mitochondriale et traite des traits pour Holsteins. Dans deux études, RFI a été comparée en bovins de boucherie au taux de respiration mitochondriale (État 3, État 4 et RCR) dans le muscle mitochondries9,10. Les taux de la respiration mitochondriale ont changé en réaction à la DMI et faibles taux étaient associés à bouvillons de boeuf moins efficaces. Dans une autre étude, RFI de boeufs de hautes ou basses bulls RFI ont été comparés avec des taux de la respiration mitochondriale et la cinétique de fuite de protons entre les deux groupes de descendants11. Différences étaient attribuables à gain en confirmant la conclusion que le gain n’est pas impact la respiration mitochondriale en bovins de boucherie.
Dans cet article, une expérience examinant foie RCR en réponse à l’alimentation des bovins laitiers en lactation 3 minéraux antioxydants illustre l’utilisation de méthodes de mesure de consommation d’oxygène pendant 4 d’État et état 3 la respiration et au CMR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le point le plus critique dans le protocole est obtenir un échantillon représentatif de tissu hépatique et commence l’isolation des mitochondries dès que possible après la biopsie. Variations dans les mesures de la respiration sont faible (tableau 1) en raison d’un temps de transport court de vache au laboratoire. Afin de réduire les temps de transport, un petit laboratoire a été mis en place dans le Bureau de la laiterie, et échantillons de foie ont été chassés au laboratoire du bureau c…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par Alltech et USDA Hatch des fonds du centre santé animale de nourriture à UC Davis School of Veterinary Medicine.
Materials
| Liver Biopsy | |||
| Equipment | |||
| Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument | Sontec Instruments Englewood CO | 1103-904 | |
| Suture | Fisher Scientific | 19-037-516 | |
| Suture needles | NA | NA | Included with Suture |
| Scalpels | Sigma – Aldrich | S2896 / S2646 | # for handle and blades |
| Surgery towels | Fisher Scientific | 50-129-6667 | |
| Falcon tubes 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Tweezers | Sigma – Aldrich | Z168750 | |
| 50 mL syringes | Fisher Scientific | 22-314387 | |
| Injection needles (22, 2 1/2) | VWR | MJ8881-200342 | |
| Cow halter | Tractor Supply Co. | 101966599 | |
| Cotton swabbing | Fisher Scientific | 14-959-102 | |
| cotton gauze squares (4×4) | Fisher Scientific | 22-246069 | |
| Medical scissors | Sigma – Aldrich | Z265969 | |
| Chemicals | |||
| Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow | Provided by Veterinarian | ||
| Clostridia Vaccine | Provided by Veterinarian | ||
| Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days | Provided by Veterinarian | ||
| Providone Scrub | Aspen Veteterinary Resources | 21260221 | |
| Ethanol 70% | Sigma – Aldrich | 793213 | |
| Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight | Provided by Veterinarian | ||
| 2% lidocaine HCl (10-15 mL) | Provided by Veterinarian | ||
| 1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine | Provided by Veterinarian | ||
| Isolation of Mitochondria (liver) | |||
| Equipment | |||
| Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance | Fisher Scientific | 02-911-527 | |
| Homogenizer Motor | Cole Parmer | EW-04369-10 | |
| Homogenizer Probe | Cole Parmer | EW-04468-22 | |
| Auto Pipette (10 mL) | Cole Parmer | SK-21600-74 | |
| Beaker (500 mL) with ice | Fisher Scientific | FB100600 | |
| Refrigerated microfuge | Fisher Scientific | 75-002-441EW3 | |
| Microfuge tubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | AM12400 | |
| Chemicals | |||
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader) | abcam | ab102536 | |
| Sucrose | Sigma – Aldrich | S7903-1KG | |
| Tris-HCl | Sigma – Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma – Aldrich | EDS-1KG | |
| BSA (fatty acid free) | Sigma – Aldrich | A7030-50G | |
| Mannitol | Sigma – Aldrich | M4125-1KG | |
| Deionized water | Sigma – Aldrich | 38796 | |
| Hepes | Sigma – Aldrich | H3375-500G | |
| Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA, pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator | |||
| Mitochondrial Oxygen Comsuption | |||
| Equipment | |||
| Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode | Hansatech (PP Systems) | OXY1 | |
| Thermoregulated Water Pump | ADInstruments | MLE2001 | |
| Clark type Oxygen electrode | NA | NA | |
| Autopipette (1 mL) | Cole Parmer | SK-21600-70 | Included with Oxy1 |
| Small magnetic stir bar | Fisher Scientific | 14-513-95 | |
| Micropipette (10 μL) | Cole Parmer | SK-21600-60 | |
| pH meter | VWR | ||
| Chemicals | |||
| KCl | Sigma – Aldrich | P9333-1KG | |
| Hepes | Sigma – Aldrich | H3375-500G | |
| KH2PO4 | Sigma – Aldrich | P5655-1KG | |
| MgCl2 | Sigma – Aldrich | M1028-100ML | |
| EGTA | Sigma – Aldrich | E3889-100G | |
| Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA | |||
| Rotenone (4 mM solution) | Sigma – Aldrich | R8875-5G | |
| Succinate (1 M solution) | Sigma – Aldrich | S3674-250G | |
| ADP (100 mM solution) | Sigma – Aldrich | A5285-1G | |
| Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol) | Sigma – Aldrich | 75351 | |
| FCCP | Sigma – Aldrich | C2920 | |
| Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force | |||
| Equipment | |||
| TPMP electrode | World Precision Instruments. | DRIREF-2 | |
| Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs | |||
| Malonate (0.1 mM solution) | Sigma – Aldrich | M1296 | |
| Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma – Aldrich | 75351 | |
| Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma – Aldrich | N7143 | |
| FCCP | Sigma – Aldrich | C3920 | |
| TPMP | Sigma – Aldrich | T200 | |
| TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA | |||
Referências
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