לוח Immunofluorescence מולטיפלקס אוטומטיות חיסונית-אונקולוגיה במחקרים על דגימות רקמה קרצינומה פורמלין-קבוע
Summary
פרוטוקול מפורט עבור לוח שש-marker immunofluorescence מולטיפלקס אופטימיזציה שבוצעו, באמצעות הוספת גוון לסמלים אוטומטיות עבור תוצאות עקביות יותר זמן הליך קצר יותר. גישה זו ניתן להתאים ישירות על ידי כל מעבדה לחקר חיסונית-אונקולוגיה.
Abstract
המשך ההתפתחויות חיסונית-אונקולוגיה דורשות הבנה מוגברת של המנגנונים של סרטן אימונולוגיה. ניתוח immunoprofiling של דגימות רקמה של פורמלין-קבוע, פרפין-מוטבע ביופסיות (FFPE) הפך להיות כלי מרכזי להבנת המורכבות של הגידול אימונולוגיה, גילוי סמנים ביולוגיים חזוי הרומן על חיסוני סרטן. ניתוח Immunoprofiling של רקמות דורש הערכת סמנים משולב, כולל תאים דלקתיים subpopulations ואת המערכת החיסונית מחסומים, microenvironment הגידול. כניסתו של הרומן immunohistochemical מולטיפלקס שיטות מאפשר ניתוח multiparametric יעיל יותר של מקטעי רקמת בודד מאשר monoplex רגיל אימונוהיסטוכימיה (IHC). אחד immunofluorescence מולטיפלקס זמינים מסחרית (אם) שיטה המבוססת על tyramide-אות הגברה, בשילוב עם ניתוח מיקרוסקופי מולטי ספקטריאליות, מאפשר הפרדה אות טוב יותר של סמני מגוונות בתוך הרקמה. מתודולוגיה זו הוא תואם השימוש unconjugated נוגדנים העיקריים מוטבו עבור IHC רגיל על דגימות רקמה FFPE. במסמך זה אנו נתאר בפירוט פרוטוקול אוטומטית המאפשרת מולטיפלקס אם תיוג של דגימות רקמה קרצינומה עם פאנל נוגדן מולטיפלקס שש-marker הכוללת PD-L1, PD-1, CD68, CD8, Ki-67 ו- AE1/AE3 cytokeratins עם 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole כמו counterstain גרעין התא. פרוטוקול לוח רב-חלקים ממוטבת ב הוספת גוון לסמלים IHC אוטומטיות לזמן מוכתמים, כי היא קצרה יותר מזו של פרוטוקול ידני, ניתן ישירות חלה על ידי כל חוקר המעבדה ללימודי חיסונית-אונקולוגית על דגימות רקמה אנושית של FFPE. תיארו גם הם מספר פקדים, כלים, כולל שיטת בקרת ירידה לבקרת איכות בסדר של לוח אם חדש מולטיפלקס, שימושיות עבור אופטימיזציה ואימות של הטכניקה.
Introduction
ניתוח Immunoprofiling של דגימות רקמה FFPE הגידול הפך מרכיב חיוני של מחקרים חיסונית-אונקולוגיה, במיוחד עבור גילוי של אימות של סמנים ביולוגיים חזוי הרומן על חיסוני סרטן בהקשר של ניסויים קליניים1 ,2. IHC הדפסות כסף, שימוש chromogens כימיים כגון diaminobenzidine, נשאר טכניקה סטנדרטית בפתולוגיה אבחון עבור immunolabeling של ביופסיה רקמות3. IHC רגיל יכול לשמש גם עבור סרטן רקמות immunoprofiling, כולל את כימות של subpopulations של לימפוציטים סרטניים הקשורים והערכה של רמות הביטוי של מחסומים מערכת החיסון כגון ליגנד מוות תאים מתוכנת 1 (PD-L1)4 ,5. IHC רגיל הוא מוגבל, אולם זה אנטיגן אחד בלבד יכול להיקרא לכל סעיף הרקמה. מאחר immunoprofiling מחקרים דורשות בדרך כלל הניתוח של הביטוי בשילוב של מספר סמנים, השימוש IHC סטנדרטי ידרוש צביעה של רקמת מקטעים מרובים, אחד צבעונית עם סמן בודד, ויהיה, לכן, מוגבל באופן משמעותי לניתוח של דגימות רקמה קטנות כגון ביופסיות מחט הליבה. בשיטות הרגילות IHC מוגבלים גם להערכה של סמנים הן coexpressed על ידי אוכלוסיות מגוונות תא, כפי שמקובל עם סמנים מחסום מערכת החיסון כגון PD-L1, הבאה לידי ביטוי על ידי מקרופאגים סרטניים הקשורים והן תאים סרטניים. מגבלה זו דווחה על-ידי פתולוגים לניתוח כמותי של סמן IHC לידי תא מגוון סוגי6ב, למשל, השימוש הרגיל monoplex IHC. התפתחות טכניקות IHC הדפסות כסף מולטיפלקס העסקת מגוונות chromogens צבעוניים על מייצג סעיף זהה רקמת קידום על פני השיטה IHC monoplex סטנדרטי,7 למרות הם נשארים מוגבל על-ידי immunolabeling של כמה סמני ולהציג גם מהווה אתגר טכני חשוב על הערכה נכונה של סמני לידי ביטוי באותו התאים subcellular של אוכלוסיות תאים באותו.
ההליכים הנ ל לגבי זמינות הרקמה דגימות קליניות, כמו גם המגבלות של מולטיפלקס טכניקות IHC הדפסות כסף, נתנו עלייה על הצורך לפתח שיטות מולטיפלקס משופרת ללימודי חיסונית-אונקולוגיה בהתאם תיוג פלורסנט בשילוב עם מערכות זה יעיל יכול להפריד את האותות של fluorophores מרובים לאותה השקופית הדמיה. טכניקה אחת כזו מבוססת על tyramide אות הגברה (TSA) בשילוב עם מיקרוסקופ מולטי ספקטריאליות הדמיה עבור צבע יעיל ההפרדה8. ערכת מבוסס-TSA זמינים מסחרית מעסיקה fluorophores אופטימיזציה עבור הדמיה מולטי ספקטריאליות8 (ראה טבלה של חומרים). יתרון קריטי של מערכת זו הוא התאימות שלו עם אותו ללא תווית העיקרי נוגדנים כבר מאומת, אופטימיזציה עבור תקן הדפסות כסף IHC9,10,11. פעולה זו מאפשרת לא רק אופטימיזציה מהירה יותר, אלא גם גמישות ב השינויים אופטימיזציה ו לוח שילוב מטרות חדשות. יתר על כן, ניתן למטב את שיטת TSA מולטיפלקס immunofluorescence (mIF) זמינים מסחרית במערכות הוספת גוון לסמלים IHC אוטומטי, המאפשר העברה ישירה של monoplex IHC הדפסות כסף כדי mIF.
כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור לוח mIF ללימודי חיסונית-אונקולוגיה המבוסס על אוטומטי mIF TSA מכתים ומשתמש בסורק מולטי ספקטריאליות עבור הדמיה. פרוטוקול זה יכול להיות הותאם, שונה על ידי כל משתמש מעבדה עם גישה מכשור המתואר, ריאגנטים. הפרוטוקול כולל פאנל של שישה ראשי נוגדנים עבור immunoprofiling של קרצינומות: PD-L1, PD-1, CD68 (כמו סמן פאן-מקרופאג), CD8 (תאי T-ציטוטוקסיות), Ki-67, ו AE1/AE3 (פאן-cytokeratin, משמש סמן אפיתל לצורך הזיהוי קרצינומה של תאים). מחקר שנערך לאחרונה מתאר אופטימיזציה של פרוטוקול mIF TSA ידנית באמצעות הדפסות כסף IHC כהפניה סטנדרטי כדי לאמת את תירגע צביעת12. השיטה מעודכן המובאת כאן פותחה באמצעות ערכת TSA זמינים מסחרית, שבע-צבע באופן ממוכנת הוספת גוון לסמלים, באופן דרסטי קיצור הזמן מכתימים מ 3 – 5 ימים ש 14, תוך גם שיפור מרקם של ההכתמה מיטבי. בנוסף הראשי פרוטוקול מפורט המובאת כאן, מקטע תוספת חומרים כולל שיטת “טיפה-שליטה”, תהליך בקרת איכות נוספים כדי להעריך את פאנל mIF חדש, כמו גם הערות טכניות עבור אופטימיזציה, פתרון בעיות, פיתוח של פאנלים מולטיפלקס חדשים כדי לסייע למשתמש מעבדה כדי להגדיר ולמטב את השיטה TSA mIF לפאנלים mIF מותאם אישית.
Protocol
Representative Results
Discussion
המהפכה חיסוני סרטן מתמשך הוא פתיחת הרומן ומבטיח אפשרויות טיפוליות עבור חולי סרטן13. ההתקדמות בתחום חיסונית-אונקולוגיה דורשים ידע מוגברת של microenvironment גידול דלקתי, לא רק כדי להבין את הביולוגיה של מנגנוני החיסון המעורבים carcinogenesis, אלא גם למצוא חזוי סמנים ביולוגיים חדשים חיסוני מב…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
תמיכה העריכה סופק על ידי דבורה Shuman של MedImmune.
Materials
| "InForm 2.4.2" Software for Spectral Unmixing and Image Analysis | PerkinElmer | CLS151066 | Called "spectral unmixing software" in text |
| "Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software for Selection of MSI and Overall Slide Scan Viewing | PerkinElmer | CLS151067 | Called "QPTIFF software" in text |
| #1.5 Coverslips | Sigma Aldrich | 2975246 | |
| 200 Proof Ethanol | Koptec | V1001 | |
| 20x Tris-Buffered Saline | VWR | J640-4L | |
| Antibody Diluent | DAKO | S2203 | |
| Anti-CD68 Mouse Monoclonal | DAKO | M087601-2 | Clone PG-M1 |
| Anti-CD8 Rabbit Monoclonal | Ventana | M5392 | Clone SP239 |
| Anti-CK Mouse Monoclonal | DAKO | M351501-2 | Clone AE1/AE3 |
| Anti-ki67 Mouse Monoclonal | DAKO | M724001-2 | Clone MIB-1 |
| Anti-PD-1 Rabbit Monoclonal | Cell Signaling | #86163 | Clone D4W2J |
| Anti-PD-L1 Rabbit Monoclonal | Ventana | 790-4905 | Clone SP263 |
| Bond Dewax Solution | Leica | AR9222 | Called "dewax solution" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 1 | Leica | AR9961 | Called "ER1" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 2 | Leica | AR9640 | Called "ER2" in text |
| Bond Open Containers, 30 mL | Leica | OP309700 | Called "30 mL open containers" in text |
| Bond Open Containers, 7 mL | Leica | OP79193 | Called "7 mL open containers" in text |
| Bond Polymer Refine Detection | Leica | DS9800 | Called "chromogenic detection kit" in text |
| Bond Research Detection Kit | Leica | DS9455 | Called "research detection kit" in text |
| Bond Titration Kit | Leica | OPT9049 | Called "titration kit" in text |
| Bond Universal Covertile Novocastra | Leica | S21.2001 | Called "covertiles" in text |
| Bond Wash Solution 10X Concentrate | Leica | AR9590 | Called "10x wash solution" in text |
| BondRX Autostainer | Leica | Called "automated stainer" in text | |
| BondRX Software Version 5.2.1.204 | Leica | Called "automated stainer software" in text | |
| Opal 7-Color Automation IHC Kit | PerkinElmer | NEL801001KT | Called "multispectral staining kit" in text |
| Peroxidase Block | Leica | RE7101 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo | P36965 | Called "slide mountant" in text |
| Starfrost Slides | Fisher | 15-183-51 | |
| Vectra Polaris Multispectral Microscope with "Vectra 3.0.5" Software for Multispectral Microscope Control | PerkinElmer | CLS143455 | Called "microscope control software" in text |
Referências
- Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient’s response to cancer therapy-promises and challenges. Current Opinion in Immunology. 45, 60-72 (2017).
- Taube, J. M., et al. Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics. Modern Pathology. 31 (2), 214-234 (2018).
- Idikio, H. A. Immunohistochemistry in diagnostic surgical pathology: contributions of protein life-cycle, use of evidence-based methods and data normalization on interpretation of immunohistochemical stains. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 3 (2), 169-176 (2009).
- Rebelatto, M. C., et al. Development of a programmed cell death ligand-1 immunohistochemical assay validated for analysis of non-small cell lung cancer and head and neck squamous cell carcinoma. Diagnostic Pathology. 11 (1), 95 (2016).
- Parra, E. R., et al. Immunohistochemical and image analysis-based study shows that several immune checkpoints are co-expressed in non-small cell lung carcinoma tumors. Journal of Thoracic Oncology. 13 (6), 779-791 (2018).
- Rehman, J. A., et al. Quantitative and pathologist-read comparison of the heterogeneity of programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression in non-small cell lung cancer. Modern Pathology. 30 (3), 340-349 (2017).
- Dixon, A. R., et al. Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI Insight. 2 (14), (2017).
- Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, 47 (2015).
- Granier, C., et al. Multiplexed immunofluorescence analysis and quantification of intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606 (2018).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Ribas, A., Wolchok, J. D. Cancer immunotherapy using checkpoint blockade. Science. 359 (6382), 1350-1355 (2018).
- Gorris, M. A. J., et al. Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment. Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
- Parra, E. R., et al. Effect of neoadjuvant chemotherapy on the immune microenvironment in non-small cell lung carcinomas as determined by multiplex immunofluorescence and image analysis approaches. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 48 (2018).
- Rimm, D., Schalper, K., Pusztai, L. Unvalidated antibodies and misleading results. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (2), 457-458 (2014).
- Baskin, D. G., Hewitt, S. M. Improving the state of the science of immunohistochemistry: the Histochemical Society’s standards of practice. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 691-692 (2014).
- Freedman, L. P., et al. The need for improved education and training in research antibody usage and validation practices. Biotechniques. 61 (1), 16-18 (2016).
- Hewitt, S. M. Reproducibility: it is just good science. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (4), 223 (2016).
- Uhlen, M., et al. A proposal for validation of antibodies. Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).
