Pannello di immunofluorescenza Multiplex automatizzato per gli studi di Immuno-oncologia su campioni di tessuto in formalina Carcinoma
Summary
Un protocollo dettagliato per un pannello indicatore di sei multiplex immunofluorescenza è ottimizzato ed eseguito, utilizzando un coloratore automatico per risultati più coerenti e un tempo di procedura più breve. Questo approccio può essere adattato direttamente da qualsiasi laboratorio per studi di immuno-oncologia.
Abstract
Continui sviluppi in immuno-oncologia richiedono una maggiore comprensione dei meccanismi di immunologia del cancro. L’analisi di immunoprofiling dei campioni di tessuto da biopsie (FFPE) formalina-fisso e paraffina-incastonato è diventata uno strumento fondamentale per la comprensione della complessità dell’immunologia dei tumori e alla scoperta di nuovi biomarcatori predittivi per immunoterapia del cancro. Immunoprofiling analisi dei tessuti richiede la valutazione degli indicatori combinati, compreso sottopopolazioni delle cellule infiammatorie e immunitarie Checkpoint, nel microambiente tumorale. L’avvento dei metodi immunohistochemical multisala romanzo consente una più efficiente analisi multiparametrica delle sezioni del tessuto singolo rispetto a standard Levansucrasi immunohistochemistry (IHC). Una immunofluorescenza multiplex disponibile in commercio (se) metodo è basato sull’amplificazione del segnale di microarray e, combinato con l’analisi al microscopio multispettrale, consente una migliore separazione del segnale dei diversi marcatori nel tessuto. Questa metodologia è compatibile con l’uso di anticorpi primari non coniugati che sono state ottimizzate per standard IHC su campioni di tessuto FFPE. Qui descriviamo dettagliatamente un protocollo automatizzato che consente multiplex se etichettatura dei campioni di tessuto di carcinoma con un pannello di sei-marker della malattia multisala composta da PD-L1, PD-1, CD68, CD8, Ki-67 e i cytokeratins AE1/AE3 con 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole come una colorazione nucleare delle cellule. Il protocollo di pannello multiplex è ottimizzato in un coloratore automatico di IHC per un tempo di colorazione che è inferiore a quella del protocollo manuale e può essere direttamente applicato e adattato da qualsiasi ricercatore di laboratorio per gli studi di immuno-oncologia su campioni di tessuto umani FFPE. Sono anche descritti diversi controlli e strumenti, tra cui un metodo di controllo di goccia per controllo di qualità fine di un nuovo pannello se multiplex, che sono utili per l’ottimizzazione e convalida della tecnica.
Introduction
Immunoprofiling analisi dei campioni di tessuto tumorale FFPE è diventata una componente essenziale degli studi di immuno-oncologia, in particolare per la scoperta e validazione di nuovi biomarcatori predittivi per immunoterapia del cancro nel contesto di studi clinici1 ,2. Cromogenico IHC, utilizzando cromogeni chimici quali diaminobenzidina, rimane la tecnica standard in patologia diagnostica per il immunolabeling di biopsia del tessuto3. IHC standard può essere utilizzato anche per il cancro del tessuto immunoprofiling, compresa la quantificazione delle sottopopolazioni dei linfociti tumore-collegati e la valutazione dei livelli di espressione di checkpoint immuni come ligando di morte programmata delle cellule 1 (PD-L1)4 ,5. IHC standard è limitata, tuttavia, in quanto solo un antigene possa essere etichettato per ogni sezione del tessuto. Perché gli studi immunoprofiling in genere richiedono l’analisi dell’espressione combinata di parecchi indicatori, l’uso di IHC standard richiederebbe la colorazione di sezioni di tessuto più, ciascuno macchiato con un singolo marker e, pertanto, sarebbe limitata sostanzialmente per l’analisi di piccoli campioni di tessuto quali le biopsie dell’ago di nucleo. Metodi standard di IHC sono anche limitati per la valutazione degli indicatori che sono coespressi di popolazioni di cellule diverse, come è comune con gli indicatori checkpoint immuni quali PD-L1, che è espresso da macrofagi associati al tumore e cellule tumorali. Questa limitazione è stata segnalata in, ad esempio, l’uso di standard Levansucrasi IHC dai patologi per l’analisi quantitativa di un marcatore IHC espresso dalla cella diversi tipi6. Lo sviluppo di tecniche IHC cromogenici multiplex che impiegano diversi cromogene colorate sulla stessa tessuto sezione rappresenta un avanzamento sopra il metodo standard di Levansucrasi IHC,7 anche se rimangono limitato dalla immunolabeling di pochi marcatori e presenti anche un’importante sfida tecnica per la corretta valutazione di marcatori espressi nei compartimenti subcellulari stessi delle stesse popolazioni cellulari.
Le suddette avvertenze relative alla disponibilità di tessuto da campioni clinici, così come le limitazioni delle multisala cromogenici tecniche IHC, hanno dato origine alla necessità di sviluppare metodi migliori multisala per studi di immuno-oncologia basati su Contrassegno fluorescente combinati con sistemi che possono efficacemente separare i segnali di fluorofori più dalla stessa diapositiva di imaging. Una tale tecnica è basata sull’amplificazione di segnale di microarray (TSA) combinato con formazione immagine di microscopia multispettrali per colore efficiente separazione8. Un kit disponibile in commercio basati su TSA impiega fluorofori ottimizzato per imaging multispettrale8 (Vedi Tabella materiali). Un vantaggio fondamentale di questo sistema è la sua compatibilità con gli anticorpi primari senza etichetta stessi che già sono stati convalidati e ottimizzato per standard cromogenico IHC9,10,11. Questo consente non solo di ottimizzazione più veloce ma anche di flessibilità le modifiche al pannello e ottimizzazione che incorporano nuovi obiettivi. Inoltre, il metodo di immunofluorescenza multiplex (mIF) TSA può essere ottimizzato per commercialmente disponibili sistemi automatizzati di stainer IHC, consentendo per un semplice trasferimento da Levansucrasi cromogenico IHC MIF.
Qui presentiamo un protocollo per un pannello di mIF per studi di immuno-oncologia che si basa su mIF TSA colorazione automatizzata e utilizza uno scanner multispettrale per l’imaging. Questo protocollo può essere adattato e modificato da qualsiasi utente di laboratorio con accesso alla strumentazione descritta e reagenti. Il protocollo include un pannello di sei anticorpi primari per l’immunoprofiling dei carcinomi: PD-L1, PD-1, CD68 (come marcatore pan-macrofago), CD8 (cellule T citotossiche), Ki-67 e AE1/AE3 (vaschetta-cytokeratin, utilizzato come indicatore epiteliale per l’identificazione di cellule di carcinoma). Un recente studio descrive l’ottimizzazione di un protocollo di mIF TSA manuale utilizzando cromogenico IHC come uno standard di riferimento per convalidare il multiplex macchiatura12. Il metodo aggiornato qui presentato è stato sviluppato utilizzando un kit TSA commercialmente disponibili, sette colori ottimizzato in un coloratore automatico, accorciando drasticamente il tempo di colorazione da 3 – 5 giorni alle 14h, migliorando anche la consistenza della colorazione. Oltre al protocollo principale dettagliato presentato qui, una sezione di Materiali supplementari include il metodo “goccia-control”, un processo di ulteriore controllo di qualità per valutare un nuovo pannello di mIF, come pure le note tecniche per l’ottimizzazione, risoluzione dei problemi e lo sviluppo di nuovi pannelli multiplex per aiutare l’utente di laboratorio per configurare e ottimizzare il metodo TSA mIF per pannelli personalizzati mIF.
Protocol
Representative Results
Discussion
La rivoluzione di immunoterapia del cancro in corso è romanzo di apertura e promettente opzioni terapeutiche per i pazienti di cancro13. Progressi nel campo della immuno-oncologia richiederanno una maggiore conoscenza del microenvironment del tumore infiammatorio, non solo per capire la biologia dei meccanismi immunologici coinvolti nella carcinogenesi, ma anche per trovare biomarcatori predittivi per il nuovo trattamenti basati sull’immunoterapia1,<sup class="x…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supporto editoriale è stato fornito da Deborah Shuman di MedImmune.
Materials
| "InForm 2.4.2" Software for Spectral Unmixing and Image Analysis | PerkinElmer | CLS151066 | Called "spectral unmixing software" in text |
| "Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software for Selection of MSI and Overall Slide Scan Viewing | PerkinElmer | CLS151067 | Called "QPTIFF software" in text |
| #1.5 Coverslips | Sigma Aldrich | 2975246 | |
| 200 Proof Ethanol | Koptec | V1001 | |
| 20x Tris-Buffered Saline | VWR | J640-4L | |
| Antibody Diluent | DAKO | S2203 | |
| Anti-CD68 Mouse Monoclonal | DAKO | M087601-2 | Clone PG-M1 |
| Anti-CD8 Rabbit Monoclonal | Ventana | M5392 | Clone SP239 |
| Anti-CK Mouse Monoclonal | DAKO | M351501-2 | Clone AE1/AE3 |
| Anti-ki67 Mouse Monoclonal | DAKO | M724001-2 | Clone MIB-1 |
| Anti-PD-1 Rabbit Monoclonal | Cell Signaling | #86163 | Clone D4W2J |
| Anti-PD-L1 Rabbit Monoclonal | Ventana | 790-4905 | Clone SP263 |
| Bond Dewax Solution | Leica | AR9222 | Called "dewax solution" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 1 | Leica | AR9961 | Called "ER1" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 2 | Leica | AR9640 | Called "ER2" in text |
| Bond Open Containers, 30 mL | Leica | OP309700 | Called "30 mL open containers" in text |
| Bond Open Containers, 7 mL | Leica | OP79193 | Called "7 mL open containers" in text |
| Bond Polymer Refine Detection | Leica | DS9800 | Called "chromogenic detection kit" in text |
| Bond Research Detection Kit | Leica | DS9455 | Called "research detection kit" in text |
| Bond Titration Kit | Leica | OPT9049 | Called "titration kit" in text |
| Bond Universal Covertile Novocastra | Leica | S21.2001 | Called "covertiles" in text |
| Bond Wash Solution 10X Concentrate | Leica | AR9590 | Called "10x wash solution" in text |
| BondRX Autostainer | Leica | Called "automated stainer" in text | |
| BondRX Software Version 5.2.1.204 | Leica | Called "automated stainer software" in text | |
| Opal 7-Color Automation IHC Kit | PerkinElmer | NEL801001KT | Called "multispectral staining kit" in text |
| Peroxidase Block | Leica | RE7101 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo | P36965 | Called "slide mountant" in text |
| Starfrost Slides | Fisher | 15-183-51 | |
| Vectra Polaris Multispectral Microscope with "Vectra 3.0.5" Software for Multispectral Microscope Control | PerkinElmer | CLS143455 | Called "microscope control software" in text |
Referências
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