Группа автоматизированных мультиплекс иммунофлюоресценции иммуно онкология исследований на образцах ткани формалин Исправлена карцинома
Summary
Подробный протокол является оптимизированы и шести маркер мультиплекс иммунофлюоресценции группа, с помощью автоматизированных ситечко для получения более надежного результата и продолжительности процедуры. Этот подход может быть непосредственно адаптирована в любой лаборатории для исследования иммуно онкология.
Abstract
Продолжение разработок в иммуно онкологии требуется углубление понимания механизмов иммунологии рака. Immunoprofiling анализ образцов ткани от формалин исправлена, парафин врезанных биопсий (FFPE) стал ключевым инструментом для понимания сложности иммунологии опухоли и открывая Роман интеллектуального биомаркеров для иммунотерапии рака. Immunoprofiling анализ тканей требует оценки комбинированных маркеров, в том числе субпопуляций воспалительных клеток и иммунных контрольно-пропускные пункты, в микроокружения опухоли. Появление Роман мультиплекс иммуногистохимических методов позволяет эффективнее многопараметрических анализа разделов одного ткани чем стандартные monoplex иммуногистохимии (IHC). Один из коммерчески доступных мультиплекс иммунофлюоресценции (если) метод на основе усиления tyramide сигнала и, в сочетании с многоспектральной микроскопического анализа, позволяет для лучшего разделения сигнала различных маркеров в ткани. Эта методология совместим с использованием неконъюгированной первичных антител, которые были оптимизированы для стандартных IHC на FFPE образцов тканей. Здесь мы подробно описать автоматизированных протокол, который позволяет мультиплекс если маркировка образцов ткани железы с шести маркер мультиплекс антитела группы в составе PD-L1, ПД-1, CD68, CD8, Ki-67 и AE1/AE3 cytokeratins с 4, 6-diamidino-2-phenylindole как изображение ядерных клеток. Мультиплекс группы протокол оптимизирован в автоматизированной IHC ситечко для окрашивания время, что короче, чем ручной протокола и можно непосредственно применять и адаптировать любой следователь Лаборатория иммуно онкология исследований на образцах ткани FFPE. Также описаны несколько элементов управления и инструменты, включая падение управления метод для тонкой контроля качества новых мультиплекс если группы, которые полезны для оптимизации и проверки техники.
Introduction
Immunoprofiling анализ образцов ткани тумора FFPE стала важным компонентом исследований иммуно онкологии, особенно для обнаружения и проверки Роман интеллектуального биомаркеров для иммунотерапии рака в контексте клинических испытаний1 ,2. Хромогенный IHC, используя химические chromogens например Диаминобензидин, остается стандартным методом диагностики патологии для immunolabeling биопсия тканей3. Стандартный IHC может также использоваться для immunoprofiling ткани рака, включая количественный субпопуляций лимфоцитов опухольассоциированных и оценки выражения уровни иммунных контрольно-пропускных пунктов как запрограммированной клеточной смерти лигандом 1 (PD-L1)4 ,5. Стандартный IHC является ограниченным, однако в том, что в разделе ткани могут быть помечены только один антиген. Потому что immunoprofiling исследования, как правило, требуют анализа комбинированных выражение несколько маркеров, использование стандартных IHC потребует пятнать несколько разделов ткани, каждый витражи с одного маркера и следовательно, будет существенно ограничены для анализа проб небольших ткани как биопсия иглы ядро. Стандартные методы IHC также ограничены для оценки маркеров, которые coexpressed на различных клеточных популяций, как это обычно происходит с маркерами иммунной контрольно-пропускной пункт, например PD-L1, которая выражается опухольассоциированных макрофагов и раковые клетки. Это ограничение сообщалось в, например, использование стандартных monoplex IHC патологоанатомами для количественного анализа IHC маркера, выраженных клеток различных типов6. Разработка методов мультиплекс хромогенных IHC используя разнообразные цветные chromogens на же представляет раздел ткани выдвижение над стандартным методом ИГХ monoplex,7 , хотя они остаются ограничивается immunolabeling из нескольких маркеры и также представляет важную техническую проблему для надлежащей оценки маркеров, выраженных в же субцеллюлярные отсеков же клеточных популяций.
Вышеупомянутые оговорки относительно наличия ткани из клинических образцов, а также ограничения мультиплекс хромогенных IHC методов, привели к необходимости разработки мультиплекс методов для исследования иммуно онкология, основанные на флуоресцентные метки в сочетании с изображений системы, которые могут эффективно отделить сигналы нескольких флуорофоров от тот же слайд. Один из таких методов на основе усиления сигнала tyramide (АСП) в сочетании с многоспектральной микроскопии изображений для эффективного цвета разделения8. Коммерчески доступных комплект на основе TSA применяет флуорофоров, оптимизированный для многоспектральных изображений8 (см. Таблицу материалы). Важнейшим конкурентным преимуществом этой системы является ее совместимость с же немеченого первичного антитела, которые уже были проверены и оптимизирован для стандартных хромогенных IHC9,10,11. Это позволяет не только быстрее оптимизации, но и гибкость в оптимизации и группа изменений, включения новых целей. Кроме того, метод TSA мультиплекс иммунофлюоресценции (МВС) могут быть оптимизированы для коммерчески доступных автоматизированных систем IHC Стайнер, позволяя для простой передачи от monoplex хромогенных IHC mIF.
Здесь мы представляем протокол МВС группа для исследования иммуно онкология, основанные на автоматизированных mIF TSA окрашивание и использует многоспектрального сканера для воображения. Этот протокол могут быть адаптированы и изменение пользователем любой лаборатории с доступом к описано оборудование и реагенты. Протокол включает в себя группу из шести первичных антител для immunoprofiling карциномы: PD-L1, ПД-1, CD68 (как маркер Пан макрофагов), CD8 (Т-цитотоксические клетки), Ki-67 и AE1/AE3 (pan Цитокератины, используется как эпителиального маркер для идентификации карцинома клетки). Недавнее исследование описывает оптимизации ручной TSA mIF протокола с помощью хромогенных IHC как стандартную ссылку для проверки мультиплекс, окрашивание12. Обновленный метод, представленные здесь была разработана с помощью коммерчески доступных, семь цветов TSA комплект оптимизированы в автоматизированных Стайнер, резко сокращая окрашивания время от 3 – 5 дней до 14 h, а также улучшение согласованности окрашивание. Помимо подробного основного протокола, представленные здесь в разделе Дополнительных материалов включает в себя метод «капля контроль», процесс дополнительного контроля качества для оценки новой группы МВС, а также технические примечания для оптимизации, Устранение неполадок и разработка новых мультиплекс панелей, чтобы помочь пользователю настроить и оптимизировать метод mIF TSA для заказной mIF панелей лаборатории.
Protocol
Representative Results
Discussion
Продолжающихся рака иммунотерапия революция является открытие Роман и обещая терапевтические возможности для раковых больных13. Достижения в области иммуно онкологии потребует расширения знаний воспалительной опухолью микроокружения, не только понять биологии иммунол?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Редакционная поддержка была оказана Дебора Шуман визуальной.
Materials
| "InForm 2.4.2" Software for Spectral Unmixing and Image Analysis | PerkinElmer | CLS151066 | Called "spectral unmixing software" in text |
| "Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software for Selection of MSI and Overall Slide Scan Viewing | PerkinElmer | CLS151067 | Called "QPTIFF software" in text |
| #1.5 Coverslips | Sigma Aldrich | 2975246 | |
| 200 Proof Ethanol | Koptec | V1001 | |
| 20x Tris-Buffered Saline | VWR | J640-4L | |
| Antibody Diluent | DAKO | S2203 | |
| Anti-CD68 Mouse Monoclonal | DAKO | M087601-2 | Clone PG-M1 |
| Anti-CD8 Rabbit Monoclonal | Ventana | M5392 | Clone SP239 |
| Anti-CK Mouse Monoclonal | DAKO | M351501-2 | Clone AE1/AE3 |
| Anti-ki67 Mouse Monoclonal | DAKO | M724001-2 | Clone MIB-1 |
| Anti-PD-1 Rabbit Monoclonal | Cell Signaling | #86163 | Clone D4W2J |
| Anti-PD-L1 Rabbit Monoclonal | Ventana | 790-4905 | Clone SP263 |
| Bond Dewax Solution | Leica | AR9222 | Called "dewax solution" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 1 | Leica | AR9961 | Called "ER1" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 2 | Leica | AR9640 | Called "ER2" in text |
| Bond Open Containers, 30 mL | Leica | OP309700 | Called "30 mL open containers" in text |
| Bond Open Containers, 7 mL | Leica | OP79193 | Called "7 mL open containers" in text |
| Bond Polymer Refine Detection | Leica | DS9800 | Called "chromogenic detection kit" in text |
| Bond Research Detection Kit | Leica | DS9455 | Called "research detection kit" in text |
| Bond Titration Kit | Leica | OPT9049 | Called "titration kit" in text |
| Bond Universal Covertile Novocastra | Leica | S21.2001 | Called "covertiles" in text |
| Bond Wash Solution 10X Concentrate | Leica | AR9590 | Called "10x wash solution" in text |
| BondRX Autostainer | Leica | Called "automated stainer" in text | |
| BondRX Software Version 5.2.1.204 | Leica | Called "automated stainer software" in text | |
| Opal 7-Color Automation IHC Kit | PerkinElmer | NEL801001KT | Called "multispectral staining kit" in text |
| Peroxidase Block | Leica | RE7101 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo | P36965 | Called "slide mountant" in text |
| Starfrost Slides | Fisher | 15-183-51 | |
| Vectra Polaris Multispectral Microscope with "Vectra 3.0.5" Software for Multispectral Microscope Control | PerkinElmer | CLS143455 | Called "microscope control software" in text |
Referências
- Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient’s response to cancer therapy-promises and challenges. Current Opinion in Immunology. 45, 60-72 (2017).
- Taube, J. M., et al. Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics. Modern Pathology. 31 (2), 214-234 (2018).
- Idikio, H. A. Immunohistochemistry in diagnostic surgical pathology: contributions of protein life-cycle, use of evidence-based methods and data normalization on interpretation of immunohistochemical stains. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 3 (2), 169-176 (2009).
- Rebelatto, M. C., et al. Development of a programmed cell death ligand-1 immunohistochemical assay validated for analysis of non-small cell lung cancer and head and neck squamous cell carcinoma. Diagnostic Pathology. 11 (1), 95 (2016).
- Parra, E. R., et al. Immunohistochemical and image analysis-based study shows that several immune checkpoints are co-expressed in non-small cell lung carcinoma tumors. Journal of Thoracic Oncology. 13 (6), 779-791 (2018).
- Rehman, J. A., et al. Quantitative and pathologist-read comparison of the heterogeneity of programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression in non-small cell lung cancer. Modern Pathology. 30 (3), 340-349 (2017).
- Dixon, A. R., et al. Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI Insight. 2 (14), (2017).
- Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, 47 (2015).
- Granier, C., et al. Multiplexed immunofluorescence analysis and quantification of intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606 (2018).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Ribas, A., Wolchok, J. D. Cancer immunotherapy using checkpoint blockade. Science. 359 (6382), 1350-1355 (2018).
- Gorris, M. A. J., et al. Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment. Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
- Parra, E. R., et al. Effect of neoadjuvant chemotherapy on the immune microenvironment in non-small cell lung carcinomas as determined by multiplex immunofluorescence and image analysis approaches. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 48 (2018).
- Rimm, D., Schalper, K., Pusztai, L. Unvalidated antibodies and misleading results. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (2), 457-458 (2014).
- Baskin, D. G., Hewitt, S. M. Improving the state of the science of immunohistochemistry: the Histochemical Society’s standards of practice. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 691-692 (2014).
- Freedman, L. P., et al. The need for improved education and training in research antibody usage and validation practices. Biotechniques. 61 (1), 16-18 (2016).
- Hewitt, S. M. Reproducibility: it is just good science. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (4), 223 (2016).
- Uhlen, M., et al. A proposal for validation of antibodies. Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).
