शारीरिक रूप से सक्रिय Thylakoids के अलगाव और ऊर्जा पर निर्भर प्रोटीन परिवहन परख में उनके उपयोग
Summary
हम वर्तमान प्रोटोकॉल chloroplast ट्विन arginine translocation (cpTat), स्रावी (cpSec1), और संकेत मान्यता कण (cpSRP) रास्ते के लिए शारीरिक रूप से सक्रिय thylakoids और प्रोटीन परिवहन परख के उच्च उपज अलगाव के लिए यहां मौजूद हैं ।
Abstract
Chloroplasts हरे पौधों कई आवश्यक चयापचय रास्ते बाहर ले जाने के लिए जिंमेदार में organelles हैं, सबसे विशेष रूप से प्रकाश संश्लेषण । chloroplasts के भीतर, thylakoid झिल्ली प्रणाली सभी संश्लेषक pigments घरों, प्रतिक्रिया केंद्र परिसरों, और इलेक्ट्रॉन वाहक के अधिकांश, और प्रकाश पर निर्भर एटीपी संश्लेषण के लिए जिंमेदार है । chloroplast प्रोटीन के ९०% से अधिक नाभिक में इनकोडिंग, cytosol में अनुवाद कर रहे हैं, और बाद में chloroplast में आयात किया । इसके अलावा प्रोटीन परिवहन में या thylakoid झिल्ली के पार चार translocation रास्ते में से एक का इस्तेमाल करता है । यहाँ, हम तीन ऊर्जा-निर्भर cpTat, cpSec1, और cpSRP-मध्यस्थता रास्ते के माध्यम से परिवहन परख के साथ-साथ मटर (Pisum सटिवुम), से परिवहन सक्षम thylakoids के अलगाव के लिए एक उच्च उपज विधि का वर्णन । इन तरीकों thylakoid प्रोटीन स्थानीयकरण, परिवहन ऊर्जावान, और जैविक झिल्ली भर में प्रोटीन translocation के तंत्र से संबंधित प्रयोगों को सक्षम ।
Introduction
लगभग सभी उचित chloroplast समारोह के लिए जिंमेदार proteinaceous मशीनरी के cytosol1से translocated होना चाहिए । chloroplast लिफाफे में, प्रोटीन सब्सट्रेट बाहरी झिल्ली (TOC) के translocon और भीतरी झिल्ली (टिक)2के translocon के माध्यम से आयात किया जाता है । इसके अलावा thylakoid झिल्ली और लुमेन के लिए लक्ष्यीकरण जुड़वां arginine translocation (cpTat)3के माध्यम से होता है, स्रावी (cpSec1)4, सिग्नल मान्यता कण (cpSRP)5, और सहज प्रविष्टि रास्ते6 . शारीरिक रूप से सक्रिय chloroplasts और thylakoid झिल्ली के उच्च उपज अलगाव के लिए एक विधि एक translocation घटना के ऊर्जावान और कैनेटीक्स को मापने के लिए आवश्यक है, प्रत्येक मार्ग में विविध परिवहन तंत्र को समझने के लिए, और एक स्थानीयकरण chloroplast के छह अलग डिब्बों में से किसी को ब्याज की विशेष प्रोटीन सब्सट्रेट ।
chloroplast से झिल्ली का अलगाव पर्यावरण कारकों पर बेहतर प्रायोगिक नियंत्रण प्रदान करता है (जैसे नमक और सब्सट्रेट सांद्रता के रूप में, एटीपी/GTP की उपस्थिति, और पीएच शर्तों) है कि परिवहन ऊर्जावान की माप को प्रभावित और कैनेटीक्स. इन विट्रो वातावरण में ही कारणों के लिए translocation के यंत्रवत विवरण की खोज करने के लिए उधार देता है । इसके अलावा, जबकि chloroplast प्रोटीन के स्थानीयकरण के लिए पूर्वानुमान सॉफ्टवेयर7,8में सुधार हुआ है, इन विट्रो परिवहन परख सूक्ष्म पर पुष्टि के लिए एक तेज विधि आधारित फ्लोरोसेंट परख प्रदान कि एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट टैग, संयंत्र परिवर्तन और/ यहां, हम chloroplast और मटर (Pisum सटिवुम) से thylakoid अलगाव के लिए प्रोटोकॉल मौजूद है, साथ ही साथ परिवहन परख ऊर्जा पर निर्भर thylakoid translocation रास्ते में से प्रत्येक के लिए अनुकूलित ।
Protocol
Representative Results
Discussion
Chloroplast और Thylakoid अलगाव
अत्यधिक टूटना गरीब chloroplast अलगाव में परिणाम कर सकते है और इस प्रकार ढाल में जुदाई के बाद गरीब thylakoid उपज । यह सुनिश्चित करना है कि सभी सामग्री सम्मिश्रण से पहले जलमग्न है और पूरी तरह …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह पांडुलिपि रसायन विज्ञान, भूविज्ञान, और जैव विज्ञान, ४०८ अनुदान DE-SC0017035 के माध्यम से अमेरिका के ऊर्जा विभाग के बुनियादी ऊर्जा विज्ञान के कार्यालय के विभाजन के द्वारा वित्त पोषण के साथ तैयार किया गया था
Materials
| Pisum sativum seeds | Seedway LLC, Hall, NY | 8686 – Little Marvel | |
| Miracloth | Calbiochem, Gibbstown, NJ | 475855-1 | |
| 80% Acetone | Sigma, Saint Louis, MO | 67-64-1 | |
| Blender with sharpened blades | Waring Commercial | BB155S | |
| Polytron 10-35 | Fischer Sci | 13-874-617 | |
| Percoll | Sigma, Saint Louis, MO | GE17-0891-01 | |
| Beckman J2-MC with JA 20 rotor | Beckman-Coulter | 8043-30-1180 | |
| Sorvall RC-5B with HB-4 rotor | Sorvall | 8327-30-1016 | |
| 100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 12/3/83 | Can be frozen in aliquots for future use |
| 200 mM MgATP in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 74804-12-9 | Can be frozen in aliquots for future use |
| Thermolysin in 1xIB (2mg/mL) | Sigma, Saint Louis, MO | 9073-78-3 | Can be frozen in aliquots for future use |
| HEPES | Sigma, Saint Louis, MO | H3375 | |
| K-Tricine | Sigma, Saint Louis, MO | T0377 | |
| Sorbitol | Sigma, Saint Louis, MO | 50-70-4 | |
| Magnesium Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 7791-18-6 | |
| Manganese Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 13446-34-9 | |
| EDTA | Sigma, Saint Louis, MO | 60-00-4 | |
| BSA | Sigma, Saint Louis, MO | 9048-46-8 | |
| Tris | Sigma, Saint Louis, MO | 77-86-1 | |
| SDS | Sigma, Saint Louis, MO | 151-21-3 | |
| Glycerol | Sigma, Saint Louis, MO | 56-81-5 | |
| Bromophenol Blue | Sigma, Saint Louis, MO | 115-39-9 | |
| B-Mercaptoethanol | Sigma, Saint Louis, MO | 60-24-2 |
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