Isolatie van fysiologisch actief thylakoiden en hun gebruik in energie-afhankelijke proteïne vervoer Assays
Summary
Wij presenteren protocollen hierin voor hoog rendement isolatie van fysiologisch actief ze en eiwit vervoer testen voor de chloroplast twin arginine translocatie (cpTat), secretoire (cpSec1) en signaal erkenning deeltje (cpSRP) trajecten.
Abstract
Chloroplasten zijn de organellen in groene planten verantwoordelijk voor de uitvoering van talrijke onontbeerlijke metabolische pathways, vooral fotosynthese. Binnen de chloroplasten, het thylakoïde membraan systeem herbergt alle de fotosynthetische pigmenten, reactie center complexen en het merendeel van de elektron-vervoerders, en is verantwoordelijk voor de licht-afhankelijke ATP-synthese. Meer dan 90% van chloroplast eiwitten zijn gecodeerd in de kern, vertaald in het cytosol en vervolgens geïmporteerd in de chloroplast. Verdere eiwit vervoer in of over het membraan thylakoïde maakt gebruik van een van de vier trajecten van de translocatie. Hier beschrijven we een hoog rendement methode voor isolatie van vervoer-bevoegde ze uit erwten (Pisum sativum), samen met vervoer testen door middel van de drie energie-afhankelijke cpTat, cpSec1 en cpSRP-gemedieerde trajecten. Deze methoden kunnen experimenten met betrekking tot thylakoïde eiwit lokalisatie, vervoer energetics en de mechanismen van de translocatie van de eiwitten in biologische membranen.
Introduction
Bijna alle van de eiwithoudende machine verantwoordelijk voor goede chloroplast functie moet worden translocated van het cytosol1. Op de chloroplast enveloppen, worden eiwit substraten geïmporteerd door middel van de translocon van het buitenste membraan (TOC) en de translocon van het binnenste membraan (TIC)2. Verder richt aan de thylakoïde membraan en lumen vindt plaats via de twin arginine translocatie (cpTat)3, de secretoire (cpSec1)4, het signaal erkenning deeltje (cpSRP)5en de spontane invoeging trajecten6 . Een methode voor de hoog rendement isolatie van fysiologisch actief chloroplasten en thylakoïde membranen is nodig voor het meten van de energetics en kinetiek van een translocatie-evenement, om te begrijpen van de mechanismen van de divers vervoer in elk traject, en te lokaliseren een bepaalde eiwitten substraat van belang zijn voor een van de zes verschillende compartimenten van de chloroplast.
Het isolement van de membranen van de chloroplast biedt beter experimentele controle over omgevingsfactoren (zoals zout en substraat concentraties, de aanwezigheid van ATP/GTP en pH-omstandigheden) die invloed hebben op de waardering van vervoer energetics en kinetiek. Deze in vitro -omgeving leent zich voor de verkenning van mechanistische details voor translocatie om dezelfde redenen. Bovendien, terwijl Voorspellende software voor lokalisatie van chloroplast eiwitten verbeterd7,8, bieden in vitro vervoer testen een snellere methode voor bevestiging over microscopie gebaseerde fluorescerende testen die vereisen een genetisch gecodeerde fluorescerende tag, plant transformatie en/of specifieke antilichamen. Hier presenteren we protocollen voor chloroplast en thylakoïde isolatie van erwten (Pisum sativum), alsmede voor vervoer assays geoptimaliseerd voor elk van de energie-afhankelijke thylakoïde translocatie trajecten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Chloroplast en thylakoïde isolement
Buitensporige breuk kan resulteren in slechte chloroplast isolatie en dus slechte thylakoïde opbrengst na scheiding in het verloop. Het is best om het homogeniseren van het geoogste weefsel voorzichtig door ervoor te zorgen dat al het materiaal voor het mengen en pulserende in 15 s-cycli totdat volledig gehomogeniseerd wordt ondergedompeld. Gebruik indien nodig meerdere kortere rondes van mengen met minder weefsel in elke ronde.
Al…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit manuscript was bereid met financiering door de Division of Chemical Sciences, Geowetenschappen en Biosciences, 408 Office van de basiswetenschappen van de energie van het ons ministerie van energie door middel van Grant DE-SC0017035
Materials
| Pisum sativum seeds | Seedway LLC, Hall, NY | 8686 – Little Marvel | |
| Miracloth | Calbiochem, Gibbstown, NJ | 475855-1 | |
| 80% Acetone | Sigma, Saint Louis, MO | 67-64-1 | |
| Blender with sharpened blades | Waring Commercial | BB155S | |
| Polytron 10-35 | Fischer Sci | 13-874-617 | |
| Percoll | Sigma, Saint Louis, MO | GE17-0891-01 | |
| Beckman J2-MC with JA 20 rotor | Beckman-Coulter | 8043-30-1180 | |
| Sorvall RC-5B with HB-4 rotor | Sorvall | 8327-30-1016 | |
| 100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 12/3/83 | Can be frozen in aliquots for future use |
| 200 mM MgATP in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 74804-12-9 | Can be frozen in aliquots for future use |
| Thermolysin in 1xIB (2mg/mL) | Sigma, Saint Louis, MO | 9073-78-3 | Can be frozen in aliquots for future use |
| HEPES | Sigma, Saint Louis, MO | H3375 | |
| K-Tricine | Sigma, Saint Louis, MO | T0377 | |
| Sorbitol | Sigma, Saint Louis, MO | 50-70-4 | |
| Magnesium Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 7791-18-6 | |
| Manganese Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 13446-34-9 | |
| EDTA | Sigma, Saint Louis, MO | 60-00-4 | |
| BSA | Sigma, Saint Louis, MO | 9048-46-8 | |
| Tris | Sigma, Saint Louis, MO | 77-86-1 | |
| SDS | Sigma, Saint Louis, MO | 151-21-3 | |
| Glycerol | Sigma, Saint Louis, MO | 56-81-5 | |
| Bromophenol Blue | Sigma, Saint Louis, MO | 115-39-9 | |
| B-Mercaptoethanol | Sigma, Saint Louis, MO | 60-24-2 |
Referências
- Ellis, R. Chloroplast protein synthesis: principles and problems. Sub-cellular biochemistry. 9, 237 (1983).
- Li, H. -. m., Chiu, C. -. C. Protein transport into chloroplasts. Annual review of plant biology. 61, (2010).
- Cline, K., Ettinger, W., Theg, S. M. Protein-specific energy requirements for protein transport across or into thylakoid membranes. Two lumenal proteins are transported in the absence of ATP. Journal of Biological Chemistry. 267 (4), 2688-2696 (1992).
- Skalitzky, C. A., et al. Plastids contain a second sec translocase system with essential functions. Plant physiology. 155 (1), 354-369 (2011).
- Dabney-Smith, C., Storm, A. . Plastid Biology. , 271-289 (2014).
- Kim, S. J., Jansson, S., Hoffman, N. E., Robinson, C., Mant, A. Distinct "assisted" and "spontaneous" mechanisms for the insertion of polytopic chlorophyll-binding proteins into the thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 274 (8), 4715-4721 (1999).
- Emanuelsson, O., Nielsen, H., Von Heijne, G. C. h. l. o. r. o. P. ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites. Protein Science. 8 (5), 978-984 (1999).
- Emanuelsson, O., Brunak, S., Von Heijne, G., Nielsen, H. Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Nature protocols. 2 (4), 953 (2007).
- Ling, Q., Jarvis, R. Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants. Journal of Visualized Experiments. (117), e54717 (2016).
- Lo, S. M., Theg, S. M. . Photosynthesis Research Protocols. , 139-157 (2011).
- Vernon, L. P. Spectrophotometric determination of chlorophylls and pheophytins in plant extracts. Analytical Chemistry. 32 (9), 1144-1150 (1960).
- Knott, T. G., Robinson, C. The secA inhibitor, azide, reversibly blocks the translocation of a subset of proteins across the chloroplast thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 7843-7846 (1994).
- Yuan, J., Henry, R., McCaffery, M., Cline, K. SecA homolog in protein transport within chloroplasts: evidence for endosymbiont-derived sorting. Science. 266 (5186), 796-798 (1994).
- Nohara, T., Nakai, M., Goto, A., Endo, T. Isolation and characterization of the cDNA for pea chloroplast SecA Evolutionary conservation of the bacterial-type SecA-dependent protein transport within chloroplasts. FEBS letters. 364 (3), 305-308 (1995).
- Endow, J. K., Singhal, R., Fernandez, D. E., Inoue, K. Chaperone-assisted post-translational transport of plastidic type I signal peptidase 1. Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28778-28791 (2015).
- Luirink, J., Sinning, I. SRP-mediated protein targeting: structure and function revisited. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1694 (1-3), 17-35 (2004).
- Yuan, J., Henry, R., Cline, K. Stromal factor plays an essential role in protein integration into thylakoids that cannot be replaced by unfolding or by heat shock protein. Hsp70. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (18), 8552-8556 (1993).
- Tjalsma, H., van Dijl, J. M. Proteomics-based consensus prediction of protein retention in a bacterial membrane. Proteomics. 5 (17), 4472-4482 (2005).
- Widdick, D. A., Eijlander, R. T., van Dijl, J. M., Kuipers, O. P., Palmer, T. A Facile Reporter System for the Experimental Identification of Twin-Arginine Translocation (Tat) Signal Peptides from All Kingdoms of Life. Journal of Molecular Biology. 375 (3), 595-603 (2008).
- Yuan, J., Cline, K. Plastocyanin and the 33-kDa subunit of the oxygen-evolving complex are transported into thylakoids with similar requirements as predicted from pathway specificity. Journal of Biological Chemistry. 269 (28), 18463-18467 (1994).
- Kirchhoff, H., Borinski, M., Lenhert, S., Chi, L., Büchel, C. Transversal and lateral exciton energy transfer in grana thylakoids of spinach. Bioquímica. 43 (45), 14508-14516 (2004).
- Frielingsdorf, S., Jakob, M., Klösgen, R. B. A stromal pool of TatA promotes Tat-dependent protein transport across the thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 283 (49), 33838-33845 (2008).
- Tu, C. -. J., Schuenemann, D., Hoffman, N. E. Chloroplast FtsY, chloroplast signal recognition particle, and GTP are required to reconstitute the soluble phase of light-harvesting chlorophyll protein transport into thylakoid membranes. Journal of Biological Chemistry. 274 (38), 27219-27224 (1999).
