Particulas de Lentivirus terapia gênica mediada por vetor de hepatócitos Ex Vivo para transplante autólogo em suínos

Resumo

Este protocolo destina-se a descrever o hepatócito porcina isolamento e ex vivo gene entrega para curar modelos de doenças metabólicas através do transplante de células autólogas. Embora este modelo em particular beneficia de vantagens únicas que favorecem a terapia bem sucedida, o aplicativo é uma Fundação relevante para tratar doenças adicionais e indicações.

Resumo

Terapia gênica é a escolha ideal para curar muitos erros inatos do metabolismo do fígado. Ex-vivo, vetores de Lentivirus terem sido utilizadas com sucesso no tratamento de muitas doenças hematopoiéticas em seres humanos, sua utilização oferece a expressão do transgene estável devido à capacidade do vetor para integrar o genoma do hospedeiro. Este método demonstra a aplicação ex vivo da terapia do gene dos hepatócitos para uma grande modelo animal de tirosinemia hereditária tipo eu. Este processo consiste em 1) isolamento dos hepatócitos primários do animal doador/beneficiário autólogo, 2) ex vivo entrega de gene via transdução de hepatócitos com um vetor de Lentivirus e 3) autólogo transplante de hepatócitos corrigidos através do portal injeção da veia. Sucesso do método baseia-se geralmente em cima da remoção eficiente e estéril da ressecção hepática, cuidadosa de manipulação do espécime extirpado para isolamento dos hepatócitos viáveis suficientes para transdução re-engrafting, alta porcentagem de células isoladas, e procedimentos cirúrgicos assépticos por toda parte para prevenir a infecção. Falha técnica em qualquer dessas etapas irá resultar em baixo rendimento dos hepatócitos transduzidos viáveis para transplante autólogo ou infecção do animal doador/beneficiário. O modelo de porco de tirosinemia hereditária humana tipo 1 (HT-1) escolhido para esta abordagem é excepcionalmente favorável para tal método, como até mesmo uma pequena porcentagem de enxertia das células corrigidas levará para repovoamento do fígado com células saudáveis com base em um poderoso vantagem seletiva sobre hepatócitos nativo-doentes. Embora esta selecção de crescimento não será verdadeira para todas as indicações, esta abordagem é uma Fundação para expansão em outras indicações e permite a manipulação deste ambiente para tratar doenças adicionais, ambos dentro do fígado e para além dele, enquanto controle para a exposição ao vetor viral e oportunidade para toxicidade fora do alvo e tumorigenicidade.

Introdução

Erros inatos do metabolismo do fígado são uma família de doenças genéticas que afetam coletivamente como muitos como 1 em 800 nascidos vivos¹. Muitas destas doenças são único gene defeitos² e podem ser curadas funcionalmente através da introdução de uma única cópia corrigida do gene afetado em um número suficiente de hepatócitos³. Percentagem efectiva de hepatócitos que precisa ser corrigido varia de acordo com a doença de⁴ e é largamente dependente da natureza da proteína que ele codifica, por exemplo, excretadas proteínas contra citoplasmática. Na maioria dos casos, a efi....

Protocolo

Todos os procedimentos de animais foram realizados em conformidade com as orientações institucionais e foram revistos e aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comité (IACUC) antes da realização do estudo. Procedimentos descritos aqui foram realizados em suínos machos e fêmeas branco grande fazenda (base genética de 50% Landrace/50% Large White) até 3 meses de idade que são considerados saudáveis e adequados para a cirurgia.  Os animais estão alojados socialmente excepto se for considerada incompatível pela equipe institucional cuidados veterinários.  Os animais são alimentados níveis adequados de chow duas vezes diária e observado para os sinais clínicos....

Resultados

A ressecção hepática e transplante autólogo são representados esquematicamente na Figura 1. Em uma coorte representativa de 5 porcos, que foram submetidos a ressecção hepática, a maioria tinha rendimentos de > 1 x 10⁹ hepatócitos com viabilidade de aproximadamente 80% (tabela 2), fornecendo a abundância de células para qualquer tipo de desejado manipulações, incluindo gene terapia. Cultura subsequente da parte não-transplantados.......

Discussão

Este relatório descreve uma ex vivo gene autólogo terapia abordagem para curar um modelo suíno de HT-1. Envolve uma hepatectomy parcial, seguido por ex vivo hepatócito isolamento e transdução de hepatócitos isolados com lenti vírus carregando o transgene corretivo. Hepatócitos autólogos corrigidos então são transplantados para o animal deficiente FAH através da veia porta⁸. Embora o método descrito é aplicável a todos os modelos animais grandes, com algumas modificações, o porco .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2-(2-nitro-4-trifluorometilbenzoil)-1,3-ciclohexanodiona (NTBC)	Yecuris	20-0027
12 mm Trocarte	Covidien	B12STS
5 mm Trocarte	Covidien	B5SHF
Endo Grampeador Cirúrgico 60	Covidien	EGIA60AMT
Endo Grampeador Cirúrgico 45	Covidien	EGIA45AVM
Endo Grampeador Cirúrgico 30	Covidien	SIG30AVM
Endo catch bag	Covidien	173050G
0 PDS	Ethicon	Z340H
2-0 Vicryl	Ethicon	J459H
4-0 Vicryl	Ethicon	J426H
Dermabond	Ethicon	DNX12	Curativo Estéril
Williams'-E Pó	Gibco	ME16060P1
NaHCO3	Sigma Aldrich	S8875-1KG
HEPES	Caneta	BP310-1
	Gibco	15140-122
Soro Bovino Fetal	Corning	35-011-CV
NaCl (g/L)	Sigma Aldrich	S1679-1KG
KCl (g/L)	Sigma Aldrich	P3911-500G
EGTA (g/L)	Oakwood Chemical	45172
N-acetil-L-cisteína	Oakwood Chemical	3631
(N-A-C, g/L)	Sigma Aldrich	A9165-100G
CaCl2 2H2O (g/L)	Sigma Aldrich	223506-500G
Colagenase D (mg/mL)	Crescent Chemical	17456.2
Meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM)	Corning	15-013-CV
Dexametasona	Fresenius Kabi	NDC6337
Fator de crescimento epidérmico	Gibco	PHG0314

/Strep  Fisher