Este método de separação de tripanossoma do sangue varia de acordo com sua carga de superfície, sendo menos negativo do que células de sangue de mamíferos. Sangue contaminado é colocado e tratado em uma coluna de permutador de aniões. Esse método, o mais apropriado diagnóstico para tripanossomíase africana, fornece parasitas purificadas para investigações de imunológicos, biológicas, bioquímicas, farmacêuticas e de biologia molecular.
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Artigo de método
Purificação de tripanosomas extracelulares, incluindo africanos, de sangue por permutadores de aniões (colunas de celulose-Diethylaminoethyl)
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este método permite a separação dos tripanosomas, parasitas responsáveis pela tripanossomíase africana animal e humana (chapéu), do sangue infectado. Este é o melhor método para o diagnóstico da primeira etapa de chapéu e além disso, este método de purificação do parasita permite serológico e investigações de pesquisa.
CHAPÉU é causada pela mosca tsé-tsé transmitida o Trypanosoma brucei gambiense e T. b. rhodesiense. Tripanosomas relacionadas são os agentes causadores da tripanossomíase animal. Detecção de tripanossoma é essencial para o diagnóstico, tratamento e acompanhamento de chapéu. A técnica descrita aqui é a técnica de deteção de parasita mais sensível, adaptada às condições de campo para o diagnóstico de T. b. gambiense chapéu e pode ser concluída no prazo de uma hora. Sangue é mergulhado em uma coluna de permutador de aniões (celulose DEAE) previamente ajustada ao pH 8 e tampão de eluição é adicionado. Altamente negativamente carregados de glóbulos são adsorvidos na coluna Considerando que atravessam as tripanosomas menos negativamente carregadas. Tripanosomas coletadas peletizadas por centrifugação e observadas por microscopia. Além disso, parasitas preparam-se, sem dano celular, embora mantendo sua infecciosidade.
Tripanosomas purificadas são necessárias para testes imunológicos; Eles são usados no ensaio de trypanolysis, o padrão-ouro na serologia de chapéu. Manchado de parasitas são utilizadas no teste de aglutinação de cartão (CATT) para sorologia de campo. Antígenos de tripanosomas purificadas, como a glicoproteína de superfície variante, exoantigens, também são utilizados em diversos imunoensaios. O procedimento descrito aqui é projetado para tripanosomas africanas; por conseguinte, condições cromatográficas tem que ser adaptado para cada estirpe tripanossoma e mais geralmente, para o sangue de cada espécie de hospedeiro mamífero.
Estas fascinantes patógenos são facilmente purificada e disponíveis para uso em bioquímicos, moleculares e estudos de biologia, incluindo co-cultura com células hospedeiras para investigar relações hospedeiro-parasita a nível dos receptores de membrana, sinalização e gene da pilha expressão; drogas testes em vitro; investigação de exclusão genética, mutação ou superexpressão em processos metabólicos, a biogênese do citoesqueleto e a sobrevivência do parasita.
Introdução
O método apresentado descrito aqui, permite a separação dos tripanosomas, parasitas responsáveis pela tripanossomíase africana animal e humana (chapéu), do sangue. Este é o melhor método para o diagnóstico da primeira etapa de chapéu e além disso, este método de purificação de parasita permite robusto inquérito sorológico e pesquisa.
CHAPÉU é causada pela mosca tsé-tsé transmitida o Trypanosoma brucei gambiense e T. b. rhodesiense1. Estes protozoários parasitas multiplicam extracelularmente no sangue, linfa e líquidos intersticiais durante a primeira fase da doença (estágio hemolinfático). ....
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Protocolo
Investigações em conformidade com as orientações para o cuidado e o uso de animais de laboratório (NIH publicação n º 85±23, revista em 1996). Os protocolos foram aprovados pelo nosso Comitê de ética local.
1. os animais
- Manter camundongos Swiss (de-1) fêmeas com idade de oito a dez semanas de idade, 20-25 g, em um animal habitação facilidade quinze dias antes de cada experimento. Colocá-los em caixas ventiladas que são mantidas em um protegido, temperatura (22 ° C) e umidade (50%) controlado por quarto, com 12 horas on/off ciclo de luz.
- Dê animais livre acesso à comida e água. Minimizar a dor, sofrimento e angús....
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Resultados
Tripanosomas purificadas foram usadas em testes farmacêuticos. Parasitas são transferidas para poços de cultura contendo diluições em série de drogas específicas, sozinho ou misturado19. Observações microscópicas, avaliar a motilidade é um marcador da viabilidade, pode ser executada quando estão a ser testados apenas alguns dugs, Considerando que o ensaio da viabilidade de células AlamarBlue é um excelente método para ensaios de grande mobilidade durante
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Discussão
Tripanosomas purificadas representam um meio poderoso para estudar imunologia, bioquímica, celular e biologia molecular. Grandes extensões de dados e os resultados foram obtidos de tripanosomas, que então tem ajudado a obter informações de outras células eucarióticas30. Tripanosomas são também objecto de investigação importante e interessante porque eles criaram numerosos mecanismos que lhes permitam sobreviver e crescer em dois ambientes muito diferentes: o vetor mosca tsé-tsé e o hospedeiro mamí.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos a todos os membros do UMR 177 INTERTRYP IRD CIRAD Université de Bordeaux. Esta pesquisa foi apoiada pelo financiamento interno da Universidade de Bordeaux e apoio da ANR, LABEX ParaFrap ANR-11-LABX-0024 e da Associação pour le développement de la recherche en parasitologie et médecine tropicale e o serviço de Coopération et d'Action culturelle de L'Ambassade de France à Bangui (Centrafrique).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Pipetas de 10 mL | Falcon | 357,551 | |
| Pipetas de 2 mL | Falcon | 352,507 | |
| 50 mL | Falcon | 352,070 | |
| Centrífuga | Sigma Aldrich | 4K15 | |
| DEAE celulose | Santa Cruz | s/c- 211213 | 100 G |
| Whatman | 1,001,125 | ||
| Balão de fundo plano pescoço estreito | Duran | 21 711 76 | 6000 mL |
| Glicose | VWR | 101174Y | 500 G |
| Heparina | Sigma Aldrich | H3149-50KU | 5 000 U |
| KH2PO4 | VWR | 120 26936.260 | 500 G |
| Microscópio | Olympus | CH-20 | |
| Lamínulas de microscópio | Thermofisher scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Lâminas | de microscópioThermofisher scientific | AGAA000001 | |
| Na2HPO4 | VWR | 100 28026; 260 | 500 G |
| NaCl | VWR | 27800.291 | 1 KG |
| NaH2PO4 | VWR | 110 33616; 262 | Garrafas |
| de mídia plástica Nalgene de 500 g tamanho 125 mL | Thermofisher scientific | 342024-0125 | |
| Garrafas de mídia plástica Nalgene tamanho 500 mL | Thermofisher scientific | 342024-0500 | |
| Pipeta | Pasteur VWR | BRND125400 | |
| Penicilina 10.000 UI/Streptomycin 10.000 µ g | EUROBIO | CABPES01 OU | 100 mL |
| Fenol vermelho | Sigma Aldrich | P0290 | Seringa de 100 mL |
| Dutscher | SS+10S21381 | ||
| Capuz de cultura de tecidos | Thermoelectro Corporation | MSC-12 | |
| Trypanosoma brucei brucei | Institute of Tropical Medicine (Antuérpia, Bélgica). | ANTAT 1.1 | |
| Trypanosoma brucei gambiense | Instituto de Medicina Tropical (Antuérpia, Bélgica). | ITMAP 1893 | |
| Trypanosoma musculi | London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK) | Partinico II |
Referências
- Büscher, P., Cecchi, G., Jamonneau, V., Priotto, G. Human African trypanosomiasis. Lancet. 390 (10110), 2397-2409 (2017).
- Lejon, V., Bentivoglio, M., Franco, J. R. Human African trypanosomiasis. Handbook of Clinical Neurology. 114, 169-181 (2013).
- Giordani, F., Morrison, L. J., Rowan, T. G., De Koning, H. P....
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Reimpressões e permissões
