Reinigung der extrazellulären Trypanosomen, einschließlich Afrika, aus Blut von Anionen-Austauscher (Diethylaminoethyl-Zellulose Spalten)
Summary
Diese Methode der Trypanosomen Trennung vom Blut hängt ihre Oberflächenladung wird weniger negativ als Blut Säugerzellen. Infiziertem Blut ist platziert und auf ein Anion-Exchanger Spalte behandelt. Diese Methode, die passende Diagnose für afrikanische Trypanosomiasis, bietet gereinigte Parasiten für immunologische, biologische, biochemische, pharmazeutische und molekularbiologischen Untersuchungen.
Abstract
Diese Methode ermöglicht die Trennung von Trypanosomen, Parasiten verantwortlich für tierische und menschliche afrikanische Trypanosomiasis (Hut), von infiziertem Blut. Dies ist die beste Methode für die Diagnose der ersten Phase HAT und außerdem dieser Parasit Reinigungsverfahren ermöglicht serologische und Forschung Untersuchungen.
Hut wird durch Tsetse-Fliege übertragen Trypanosomen Trypanosomen rhodesiense verursacht und T. B. Rhodesiense. Damit verbundenen Trypanosomen sind die Erreger der Tier Trypanosomiasis. Trypanosomen-Erkennung ist essentiell für Hut-Diagnose, Behandlung und Nachsorge. Die hier beschriebene Technik ist die empfindlichste Parasit Erkennung Technik, angepasst auf Freilandbedingungen für die Diagnose von T. B. rhodesiense Hut und kann innerhalb einer Stunde abgeschlossen sein. Blut wird auf ein Anion-Exchanger Säule (DEAE Zellulose) vorher eingestellten pH-Wert 8 geschichtet und Elution Puffer hinzugefügt. Stark negativ geladenen Blutzellen werden auf die Säule adsorbiert, während die weniger negativ geladenen Trypanosomen durchlaufen. Gesammelten Trypanosomen sind pelleted durch Zentrifugation und beobachtet von Mikroskopie. Darüber hinaus sind Parasiten ohne Zellschädigung bereit, unter Beibehaltung ihrer Infektiosität.
Gereinigte Trypanosomen sind erforderlich für immunologische Tests; Sie sind in der Trypanolysis-Assay, der Goldstandard in der Hut Serologie eingesetzt. Gefärbte Parasiten sind in der Karte Agglutination Test (CATT) für Feld Serologie genutzt. Antigene von gereinigten Trypanosomen wie Variante Oberfläche Glykoprotein, Exoantigens, sind auch in verschiedenen Immunassays verwendet. Die hier beschriebene Vorgehensweise richtet sich an afrikanischen Trypanosomen; Infolgedessen haben Chromatographie Bedingungen zu jeder Trypanosomen-Stamm, und ganz allgemein an das Blut der einzelnen Arten der Host Säugetier angepasst werden.
Diese faszinierenden Krankheitserreger sind leicht gereinigt und zur Verfügung in biochemische, molekulare und Zelle Biologie Studien einschließlich Kokultur mit Wirtszellen zu untersuchen, Wirt-Parasit-Beziehungen auf der Ebene der Membranrezeptoren, Signal- und gen Ausdruck; Drogen Sie-Tests in Vitro; Untersuchung von gen-Löschung, Mutation oder Überexpression auf metabolische Prozesse, Zellskelett Biogenese und Parasiten überleben.
Introduction
Die vorgestellte Methode beschrieben hier ermöglicht die Trennung von Trypanosomen, Parasiten verantwortlich für tierische und menschliche afrikanische Trypanosomiasis (Hut), aus Blut. Dies ist die beste Methode für die Diagnose der ersten Phase HAT und außerdem ermöglicht dieser Parasit Reinigungsverfahren robuste serologische und Forschung Untersuchung.
Hut, verursacht durch Tsetse-Fliege übertragen Trypanosomen Trypanosomen rhodesiense und T. B. Rhodesiense1. Diese Protozoen Parasiten vermehren extrazellulär in Blut, Lymphe und interstitiellen Flüssigkeiten in der ersten Phase der Erkrankung (hemolymphatic Stadium). Die zweite Stufe (meningoencephalitic Stadium) beginnt, wenn die Parasiten die Blut-Hirn-Schranke überqueren; neurologische Symptome, einschließlich einer Schlafstörung, die seinen Namen “Schlafkrankheit” dieser Krankheit gegeben hat, sind typisch für diese zweite Stufe2. Damit verbundenen Trypanosomen (T. Evansi, T. Congolense, T. Vivax, T. B. Trypanosomen) sind die Erreger der afrikanischen Trypanosomosen (AAT)3Tier.
Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) zielt darauf ab, Hut als Problem der öffentlichen Gesundheit bis zum Jahr 2020 zu beseitigen und Übertragung von 20304zu stoppen. Die kürzlich erfolgten Einführung der raschen Diagnosetests hat verbesserte serologische Diagnostik1,4,5. Wurden mehrere molekulare Diagnostik entwickelt, aber ihre Rolle im Bereich Diagnostik wurde noch nicht etablierten5. Sie werden verwendet, um die Unterarten der Trypanosomen -Gruppe und atypische Trypanosomiasis verursacht durch Parasiten verantwortlich für tierische Trypanosomosen6zu identifizieren.
Die Erkennung des Parasiten ist wichtig für die Diagnose, Behandlung und Nachsorge, da Serologie falsch positive und leider falsch-negative Ergebnisse1geben kann. Die direkte mikroskopische Beobachtung von diesen Hemoflagellate Protisten ist schwierig in Hut-Fällen, die von T. B. rhodesiense, (mehr als 95 % der Fälle) verursacht werden können, wie niedrige Parasitemias die Regel sind, während T. B. Rhodesiense, einen großen Hut durch Anzahl der Parasiten sind häufig im Blut vorhanden. Verschiedene Techniken der Konzentration verwendet worden sind, wie dicke Tropfen und Kapillarrohr Zentrifugation (CTC), aber die Trennung der Parasiten von Blut durch eine Spalte der Anionen-Austauscher (DEAE Zellulose) gefolgt von Zentrifugation und mikroskopische Beobachtung von der Pellet, ist die empfindlichste Methode (rund 50 Parasiten/mL Blut nachweisbar)1,7. Folglich ist die Reinigung der Trypanosomen Anionen-Austauscher (DEAE Zellulose) dadurch das beste und bis heute ist die Referenzmethode zur Visualisierung und Parasiten aus Blut für Hut-Diagnose zu isolieren. Unter Feldbedingungen eine Mini-Spalte der DEAE Cellulose erfolgreich eingesetzt und mehrere Verbesserungen konnten mikroskopischen Beobachtung7,8.
Die Methode der Trypanosomen Trennung von Blut, wie unten beschrieben, hängt Parasit Oberflächenladung, die weniger negativ als Blut Säugerzellen9ist. Interessanterweise ist diese Methode entwickelte sich vor 50 Jahren, im Jahr 1968 von Dr. Sheila Lanham, und bleibt der Goldstandard für Erkennung und Vorbereitung der Trypanosomen Blutbahn. Es ist schnell und reproduzierbar für Salivarian Trypanosomen aus einer Vielzahl von Säugetieren, erlaubt die Diagnose sowohl tierische und menschliche Trypanosomiasis10.
Um lebendige, gereinigten Parasiten zu erhalten, wird infiziertes Blut auf ein Anion-Exchanger-Spalte hinzugefügt. Chromatographie-Bedingungen (vor allem pH-Wert, Ionenstärke der Puffer/Medien) müssen für die einzelnen Trypanosomen-Arten, und ganz allgemein für jede Mischung von Säugerzellen Blut und Trypanosomen10angepasst werden. Elution Buffer ist genau auf pH 8 für die meisten afrikanischen Trypanosomen10eingestellt. Diese Methode begünstigt die Konzentration der Parasiten im Blut von Patienten gefunden, weil Parasitemias zu niedrig, um durch mikroskopische Beobachtung allein erkannt werden können, und es ermöglicht auch Laboruntersuchungen. Arbeiten mit frisch isolierte Trypanosomen und auf das Blut von infizierten Tieren, die mit dieser Technik ist mehr relevant für die verschiedenen Untersuchungen als Studien mit Parasiten, die in axenic Bedingungen im Labor auf unbestimmte Zeit kultiviert wurde.
Wirt-Parasit-Beziehungen sind am besten untersucht mit einem Parasiten infiziert seinen natürlichen Wirt, daher T. Musculi, einen natürlichen murinen Parasiten, die Vertreter der extrazellulären Trypanosomen, hat viele Vorteile, wie in murinen Infektion beinhaltet eine kleinen Versuchstier und erfordert keine Biohazard Sicherheitsbedingungen Niveau (BSL). T. Musculi tötet nicht immunkompetenten Mäusen, im Gegensatz zu vielen anderen Trypanosomen -Arten, einschließlich menschliche Krankheitserreger. T. Musculi entfallen nicht in T-Zell-beraubt Mäuse und Parasitemias kann bei infizierten Mäusen erhöht werden, indem Sie Nahrung und Nährstoff-Aufnahme11ändern. Dieser Parasit moduliert die Immunantwort bei Co-Infektionen mit anderen Krankheitserregern12. T. Musculi von infizierten Mäusen Ausstellung Unterschiede von kultivierten T. Musculi, z. B. der Ausdruck von Membranrezeptoren Fc T. Musculi axenic Kulturen, im Vergleich zu Parasiten gereinigt von infizierten Mäusen13 verliert , 14. Excreted abgesondert Faktoren (ESF) sind auch qualitativ und quantitativ weniger in axenic Trypanosomen Kulturen zum Ausdruck gebracht und unterscheiden sich zwischen den Stämmen in endemischen Gebieten15isoliert. ESF sind die ersten Antigene auf das Immunsystem des Wirts angezeigt werden und so eine wichtige Rolle in der ursprünglichen Host Immunantwort16.
Bei experimentell infizierten Tieren für Laboruntersuchungen erleichtert dieses Protokolls Experimente an einer größeren Anzahl von Parasiten, die Minimierung von Mäusen erforderlich, insbesondere bei Verwendung von immunsupprimierten Tieren. Die Variante Oberfläche Glykoproteine (VSGs), die in der Karte Agglutination Test für Trypanosomiasis (CATT) in Massen-Screening verwendet werden sind noch gereinigt von Trypanosomen, die bei Ratten übertragen werden. Die zwei diagnostische Schnelltests (einzeln verpackte Kassetten), die jetzt verfügbar sind für den Einsatz im Feld, sind immer noch mit einer infektiösen Modell Quelle der native VSGs und nicht in Vitro kultiviert Trypanosomen1,4, 5. der Fortschritt in der Studie der Trypanosomen Immunologie und Biologie wurde erleichtert, da diese DEAE Zellulose gereinigt Parasiten leicht in großen Mengen von natürlich oder experimentell infizierten Hosts und in bestimmten, Nagetiere erzielt werden können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gereinigte Trypanosomen sind ein mächtiges Mittel, Immunologie, Biochemie, zelluläre und molekulare Biologie zu studieren. Große Flächen von Daten und Ergebnissen erhielten von Trypanosomen, die hat dann dazu beigetragen, andere eukaryotische Zellen30Informationen einzuholen. Trypanosomen sind auch Gegenstand der Forschung wichtig und interessant, weil sie zahlreiche Mechanismen, die ihnen ermöglichen entwickelt haben, zu überleben und wachsen in zwei sehr unterschiedlichen Umgebungen: die T…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken allen Mitgliedern der UMR 177 INTERTRYP IRD CIRAD Université de Bordeaux. Diese Forschung wurde unterstützt durch die interne Finanzierung von Universität von Bordeaux und Unterstützung durch die ANR, LABEX ParaFrap ANR-11-LABX-0024, und von der Association pour le Développement De La recherche de Parasitologie et Médecine Tropicale und der Service de Coopération et d ‘ Action Culturelle de l’Ambassade de France À Bangui (Centrafrique).
Materials
| 10 mL Pipettes | Falcon | 357,551 | |
| 2 mL Pipettes | Falcon | 352,507 | |
| Centrifugation tube 50 mL | Falcon | 352,070 | |
| Centrifuge | Sigma Aldrich | 4K15 | |
| DEAE cellulose | Santa Cruz | s/c- 211213 | 100 G |
| filter paper | Whatman | 1,001,125 | |
| Flat bottom flask narrow neck | Duran | 21 711 76 | 6000 mL |
| Glucose | VWR | 101174Y | 500 G |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149-50KU | 5 000 U |
| KH2PO4 | VWR | 120 26936.260 | 500 G |
| Microscope | Olympus | CH-20 | |
| Microscope coverslips | Thermofisher scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Microscope slides | Thermofisher scientific | AGAA000001 | |
| Na2HPO4 | VWR | 100 28026;260 | 500 G |
| NaCl | VWR | 27800.291 | 1 KG |
| NaH2PO4 | VWR | 110 33616;262 | 500 G |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 125 mL | Thermofisher scientific | 342024-0125 | |
| Nalgene Plastic Media Bottles size 500 mL | Thermofisher scientific | 342024-0500 | |
| Pasteur Pipette | VWR | BRND125400 | |
| Penicillin 10,000 UI/Streptomycin 10,000 µg | EUROBIO | CABPES01 OU | 100 mL |
| Phenol red | Sigma Aldrich | P0290 | 100 mL |
| Syringue | Dutscher | SS+10S21381 | |
| Tissue culture hood | Thermoelectro Corporation | MSC-12 | |
| Trypanosoma brucei brucei | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ANTAT 1.1 | |
| Trypanosoma brucei gambiense | Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). | ITMAP 1893 | |
| Trypanosoma musculi | London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK) | Partinico II |
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