Hippo 신호 Luciferase 기반 큰 종양 억제기 (라트) 바이오 센서를 사용 하 여 경로 활동 모니터링

Summary

여기에 우리가 현재 큰 종양 억제기 (라트)의 키 니 아 제 활동을 계량 luciferase 기반 바이오 센서-Hippo 신호 전달 경로에 중앙 니. 이 바이오 센서는 다양 한 응용 프로그램 기본 및 변환 연구 마 통로 레 귤 레이 터에서 생체 외에서 그리고 vivo에서조사 목적에 있다.

Abstract

통로 신호 하는 마 장기 크기의 보존된 레 귤 레이 터 이며, 개발 및 암 생물학에 있는 중요 한 역할을 했다. 기술 과제 때문이 신호 통로의 활동을 평가 하 고 생물학 컨텍스트 내에서 해석 하기 어려운 남아 있다. 큰 종양 억제기 (라트)에 기존 문학 심사에 대 한 질적 고 수 없습니다 쉽게 수 수직 방법에 의존 합니다. 최근, 우리 마 키 니 아 제 폭포의 라트는 핵심 구성 요소의 키 니 아 제 활동을 모니터링 하는 생물 발광 기반 바이오 센서를 개발 했습니다. 여기, 우리 뚱 땡 통로 레 귤 레이 터 하이 라트를 바이오 센서 (라트-학사)을 사용 하는 방법을 위한 절차를 설명 합니다. 첫째, 우리 라트-학사를 사용 하 여 라트 활동에 조사는 overexpressed 단백질 후보 (예, VEGFR2)의 효과 대 한 자세한 프로토콜을 제공 합니다. 다음, 우리는 소규모 kinase 억제제 화면 라트-BS을 사용 하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜 feasibly 수직 의심할 여 지 없이 마 통로의 소설 레 귤 레이 터를 식별 것입니다 더 큰 화면을 수행할 수 있습니다.

Introduction

신호 통로 세포 성장 및 동물 크기^1,2의 소설 레 귤 레이 터로 초파리 에 처음 발견 되었다 하는 마 그것의 처음 발견부터 장착 증거 설득 나타났습니다 뚱 땡 통로 (예를 들어, 초기 미 발달 발달, 기관 크기 제어 및 3 차원 [3 차원] 형태학), 개발에 중요 한 역할을 재생 tumorigenesis ( 예를 들어, 종양 개발, 전이, 신생, 면역 회피, genomic 불안정성, 스트레스 반응, 그리고 약물 저항), 및 조직의 항상성 (예:줄기 세포 재생 및 분화, 부상 후 조직 재생) ^{3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10}. 자주 다양 한 암^{7,8,9,10,,1112}에 dysregulated는 hippo 신호. 따라서, 암 생물학과 치료제 및 재생 의학 히포 통로의 기능을 elucidating 되고있다 인기 있는 지역 중 하나 생물 의학 연구에.

에 짧은, (예를 들어, 셀 연락처, 영양 스트레스, 및 기질 [ECM]), 업스트림 레 귤 레이 터에 의해 활성화 시 마 통로에 MST1/2 (MST, 초파리 뚱 땡의 포유류 homologs) 떠들고/트레오닌 (S/T) kinases phosphorylate/활성화 접합 기 단백질 hMOB1 및 WW45는, 그 후, phosphorylate transcriptional 공동 활성 야프와 그것의 paralog 보존된 HX(H/R/K)XX(S/T) (H, 히스티딘;에 TAZ LATS1/2 (라트) kinases 뿐만 아니라 R, 아르기닌; K, lysine; S, 떠들고; T, 트레오닌; X, 어떤 아미노산) 모티프, 야프 S127와 TAZ S89^11,12를 포함 하 여. S127 phosphorylated 얍 (YAP-pS127) S89 phosphorylated TAZ (TAZ-pS89)는 ubiquitination에 의해 타락 또는 세포질 단백질 14-3-3에 바인딩할 및 하류 transactivate를 핵에서 TEAD1 4 전사 인자와 상호 작용 수 없습니다. 유전자 세포 증식 및된 apoptosis (그림 1). Hippo 신호 측정을 위한 몇 가지 도구 존재 마 통로에 엄청난 관심에도 불구 하 고 그 할 얍/TAZ/TEAD transcriptional 출력의 기자 들에 게 역사적으로 제한 되었습니다. 실제로, 아주 최근까지, 역학 및 양적, 실시간, 높은 처리량 및 비-침략 적 방식으로 구성 요소를 신호 하는 마의 활동을 측정 하기 위한 도구가 있었다 둘 다 생체 외에서 그리고 에 비보.

양적 및 실시간 방식으로^{13, 이러한 상호 작용을 공부 하는 데 사용할 수 있는 도구의 개발에 큰 관심은 우리의 신흥 생리학과 병 리에 있는 단백질 단백질 상호 작용의 역할의 이해를 감안할 때, 14,,1516}. 실제로, 효 모 2 잡종 (Y2H)¹⁷, 표면 플라스몬 공명 (SPR)¹⁸및 포스터 공명 에너지 전달 (무서 워)¹⁹ 분석 실험, 바이오 분석 전략의 개발에 큰 진전을 계속 있다 단백질 단백질 상호 작용 평가 그러나, 이러한 방식을 수행 기자 오리엔테이션의 상당한 최적화를 필요로의 한계는 효율적인 하나를 찾아 많은 구조를 테스트 해야 합니다. 또한, 이러한 방법 또한 있다 상대적으로 낮은 신호 대 잡음 비율, 그런 진정한 긍정적인 신호 분별 도전적 일 수 있다.

단백질 보완성 분석 실험은 이러한 한계를 극복 하기 위해 개발 되었다. 단백질 보완성 분석 실험의 1 세대 분할 다 색 형광 단백질을 기반으로 했다 고 상기 제한²⁰를 해결할 수 있습니다. 하나의 도메인, 낮은 선호도와 배경 잡음²¹두 개의 별도 안정 된 조각으로 그들을 분할 하 고 어려운 다 색 형광 단백질에 의하여 이루어져 있다. 그 후, 반딧불 luciferase 분할 단백질 보완성 분석 실험 개발에 사용 하기 위해 새로운 후보자로 확인 되었다. 이 방법에서는, 반딧불 luciferase 관심의 대상 단백질에 융합 하는 각 조각으로 2 개의 파편 (N-터미널 및 단자 luciferase [NLuc 및 CLuc])으로 분할 됩니다. 경우 NLuc 및 CLuc는 두 대상 단백질의 상호 작용에 따라 근접으로, luciferase 활동 재구성 하 고 발광 빛 소 기질과 ATP²²존재 생성 됩니다. 2001 년에 수행 하 여 조합 심사 NLuc 및 CLuc 파편을 포함 하는 라이브러리를 사용 하 여 다양 한 사이트에서 잘라내어 다른 링커와 단백질에 연결 된, Paulmurugan 및 스탠포드 대학에서 Gambhir 개발 최적화 된 분할-반딧불 단백질 단백질 상호 작용²³luciferase 보완성 조각 기반 시스템. 이 시스템에서 반딧불 luciferase 아미노산 (aa) 398 NLuc와 CLuc, 8 글리신 잔류물의 유연한 링커를 사용 하 여 관심사의 2 개의 단백질에 연결 하 고 두 떠들고 잔류물에서 잘라입니다.

비슷한 접근 방식을 사용 하 여, 우리 최근 개발한 새로운 라트-학사 15 NLuc 융합 S127에 라트 인 산화 사이트를 둘러싼 야프의 aa (YAP15) 및 CLuc 14-3-3. 다른 업스트림 레 귤 레이 터에 의해 (예를 들어, 다른 사이트와 ubiquitination 인 산화) 얍의 포스트 번역 상 수정에 의해 신호를 혼동 하지 않으려면 전체 길이 얍 단백질 사용 되지 않습니다 했다. 여기에 제시 된 라트 학사 비 접촉 모두 살아있는 세포에 생체 외에서 그리고 vivo에서 쥐^20,24 (그림 2)에서 활동을 신호 하는 마를 모니터링할 수 있습니다. 여기, 우리가 라트 키 니 아 제 활동에서 생체 외에서 라트-학사를 사용 하 여 측정 하기 위한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 첫째, 우리는 라트 활동에 overexpressed 단백질의 효과 조사 하는 라트-BS을 사용 하는 방법을 보여줍니다. 다음, 우리는 바이오 센서를 사용 하 여 에이전트 뚱 땡 통로 규제와 치료 후 마 통로의 활동을 모니터링 하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜 식별 및 신호 경로 또는 라트 키 니 아 제 활동을 규제 하는 자극의 특성 사용 될 수 있습니다.

Protocol

1. 마 라트-학사를 사용 하 여 신호의 Putative 레 귤 레이 터의 조사 도금 및 세포의 transfection 세포 배양의 준비 1 x PBS, 10 S 1% 페니실린/스, 및 0.25 %trypsin-EDTA 약 30 분 동안 물 욕조에 37 ° C에 포함 된 DMEM 따뜻한. 철저 하 게 청소 70% 에탄올 biosafety 내각. 필요에 따라 조직 문화 후드에 조직 문화 요리, 파스퇴르 펫, 혈 청 학적인 펫, 그리고 피 펫 팁?…

Representative Results

라트-학사 라트 활동 (그림 3)에 미치는 영향을 평가 하는 다른 유전자와 cotransfected 했다. 이 실험에서 Renilla 는 내부 제어로 사용 되었다. 야프-5SA의 일시적 표현, 얍, 제정 활성 형태의 설립된 피드백 통로25통해 라트 키 니 아 제 활동에 야프 transcriptional 대상과 후속 증가의 레벨을 증가 하는 원인. MST, 뚱 땡 통로 (<strong class="x…

Discussion

뚱 땡 통로 다양 한 생물학 과정에 중요 한 역할을 재생 하는 동안 뚱 땡 통로의 dysregulation 암⁶리드 어떻게 뚱 땡 통로 다양 한 자극에 대 한 응답에서 통제는 완전히 이해 되지. 또한, 코어 마 구성의 활동을 평가 하기 위해 아무 양적 및 실시간 시스템이 되었습니다. 최근, 우리 개발 하 고 검증 마 통로²⁴에 라트 키 니 아 제 활동을 측정 하기 위한 새로운 바이오 …

Materials

Trypsin-EDTA	Life Technologies	2520056	0.25%
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	F1051
DMEM	Sigma	D6429-500ml	DMEM with high glucose
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140122
PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent	Signagen	SL100688.5
5x Passive lysis buffer	Promega	E194A	30 ml
Dual-Glo® Luciferase Assay System	Promega	E2940	100 ml kit
20/20 luminometer	Turner Biosystems	998-2036	Single tube reader luminometer
GloMax®Navigator with dual injectors	Promega	GM2010	96-well plates reader luminometer