Beoordeling van de metabole Profiel van primaire leukemie cellen
Summary
Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van leukemische cellen van leukemie patiënten beenmerg en analyse van hun metabolische staat. Beoordeling van de metabole Profiel van primaire leukemie cellen zou kunnen bijdragen tot het beter karakteriseren de vraag van primaire cellen en omhoog zou kunnen leiden tot meer gepersonaliseerde geneeskunde.
Abstract
De metabole eis van kankercellen kan negatieve invloed hebben op overleving en doeltreffendheid van de behandeling. Tegenwoordig, wordt farmaceutische targeting van metabolische routes getest in vele soorten tumoren. Karakterisering van kanker cel metabole setup is dus onvermijdelijk om te richten het juiste traject ter verbetering van de algehele uitkomst van patiënten. Helaas, in de meeste vormen van kanker, de kwaadaardige cellen zijn vrij moeilijk is te verkrijgen in hogere aantallen en de biopsie van weefsel is vereist. Leukemie is een uitzondering, waar een voldoende aantal leukemische cellen kan worden geïsoleerd uit het beenmerg. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de isolatie van leukemische cellen van leukemie patiënten beenmerg en latere analyse van hun metabolische staat die gebruik maakt van extracellulaire flux analyzer. Leukemische cellen zijn geïsoleerd door het verloop van de dichtheid, die heeft geen invloed op hun levensvatbaarheid. De volgende stap van de teelt helpt hen om te regenereren, dus de metabole gemeten is staat de cellen in optimale omstandigheden. Dit protocol staat consistente, goed gestandaardiseerde resultaten, die kunnen worden gebruikt voor de gepersonaliseerde therapie te bereiken.
Introduction
De metabole profiel is een van de belangrijkste kenmerken van cellen en veranderde Bioenergetica zijn nu beschouwd als één van de kenmerken van de kanker1,2,3. Bovendien, wijzigingen in de metabole setup kunnen worden gebruikt in de behandeling van kanker door zich te richten signaaltransductie trajecten of enzymatische machines van kanker cellen,4,,5,6. Kennen van de metabole aanleg van kankercellen is dus een voordeel en kan helpen bij het verbeteren van de huidige therapie.
Er zijn een overvloed van reeds gevestigde methoden die van de metabole activiteit van cellen in cultuur beoordelen kunnen. Met betrekking tot de glycolyse, glucose-opname kan worden gemeten door de radioactieve labeling, met 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) of extracellulaire lactaat niveaus gemeten enzymatisch7,8. Vetzuur oxidatie tarief is een andere metabole parameter gemeten door ionenpaar gelabelde palmitaat9,10. Zuurstof verbruik tarief is een methode die veel gebruikte voor het bepalen van de mitochondriale activiteit in cellen11,12, samen met de mitochondriale membraan potentiële evaluatie13,14, ATP/ADP (adenosine 5 ‘-trifosfaat/5 ‘-adenosinedifosfaat) ratio meting15 of totaal intracellulaire ATP meting16. Signalering van trajecten bekend te reguleren metabole processen kan worden bepaald door eiwitten ondermeer en kan verbetering van het inzicht van metabole metingen17,18,19.
Echter, al deze methoden meten slechts één of, in het beste geval, een paar metabole parameters in een proeven gelijktijdig. Nog belangrijker is, kan gelijktijdige meting van de zuurstof verbruik tarief (OCR) en de extracellulaire verzuring tarief (ECAR) worden bereikt door de extracellulaire flux-analyse door, bijvoorbeeld, Seahorse XFp Analyzer. OCR is een indicator van de mitochondriale ademhaling en ECAR is vooral het gevolg van glycolyse (we niet voorbijgaan aan CO2 productie mogelijk verheffen ECAR van cellen met hoge oxidatieve fosforylatie activiteit)20. Tot nu toe zijn verschillende celtypes bestudeerd met behulp van deze analysers21,22,23.
Hier beschrijven we het protocol voor de analyse van de extracellulaire flux van primaire ontploffingen (leukemie-cellen afgeleid van de onrijpe hematopoietische fase) van leukemie-patiënten. Tot de beste van onze kennis nog een specifiek protocol voor primaire ontploffing niet beschikbaar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hierboven beschreven protocol voorziet in het meten van de metabole activiteit beoordeeld door OCR en ECAR waarden in de primaire leukemische ontploffing afgeleid van patiënten met acute lymfatische leukemie (ALL) of acute myeloïde leukemie (AML). Het voordeel van de meting met behulp van een extracellulaire flux analyzer is dat hierdoor de detectie van metabole profiel in de real time in de levende cellen. In wezen, elke stap in het meegeleverde protocol kan worden aangepast afhankelijk van het celtype een plan om…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zouden graag bedanken de Tsjechische pediatrisch hematologie centra. Dit werk werd ondersteund door de subsidie van Ministerie van volksgezondheid (NV15-28848A), door het ministerie van gezondheid van het universitaire ziekenhuis Motol, Tsjechische Republiek, Praag, Tsjechische Republiek 00064203 en door het ministerie van onderwijs, jeugd en sport Binengrenzen ik nr. LO1604.
Materials
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco, ThermoFisher Scientific | 61870-010 | |
| Fetal Bovine Serum | Biosera | FB-1001/100 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15240-062 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
| Oligomycin A | Sigma-Aldrich | 75351-5MG | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375-1G | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920-10MG | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875-1G | |
| Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674-25MG | |
| Seahorse XF Base Medium, 100 mL | Agilent Technologies | 103193-100 | |
| L-glutamine solution, 200 mM | Sigma-Aldrich | G7513-100ML | |
| HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6 | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-25G | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153-10G | |
| Ficoll-Paque Plus | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 | Density gradient medium |
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent Technologies | 103022-100 | |
| Corning™ Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | CB40240 | |
| Seahorse Analyzer XFp | Agilent Technologies | S7802A | |
| Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 |
Referências
- DeBerardinis, R. J., Lum, J. J., Hatzivassiliou, G., Thompson, C. B. The Biology of Cancer: Metabolic Reprogramming Fuels Cell Growth and Proliferation. Cell Metabolism. 7, 11-20 (2008).
- Ward, P. S., Thompson, C. B. Metabolic Reprogramming: A Cancer Hallmark Even Warburg Did Not Anticipate. Cancer Cell. 21, 297-308 (2012).
- Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism. Cell Metabolism. 23, 27-47 (2016).
- Wise, D. R., Thompson, C. B. Glutamine addiction: a new therapeutic target in cancer. Trends in Biochemical Sciences. 35, 427-433 (2010).
- Kroemer, G., Pouyssegur, J. Tumor Cell Metabolism: Cancer’s Achilles’ Heel. Cancer Cell. 13, 472-482 (2008).
- Liberti, M. V., et al. A Predictive Model for Selective Targeting of the Warburg Effect through GAPDH Inhibition with a Natural Product. Cell Metabolism. 26, 648-659 (2017).
- Lundgaard, I., et al. Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism. Nature Communications. 6, 6807 (2015).
- Hermanova, I., et al. Pharmacological inhibition of fatty-acid oxidation synergistically enhances the effect of l-asparaginase in childhood ALL cells. Leukemia. 30, 209-218 (2016).
- Malandrino, M. I., et al. Enhanced fatty acid oxidation in adipocytes and macrophages reduces lipid-induced triglyceride accumulation and inflammation. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308, E756-E769 (2015).
- Patella, F., et al. Proteomics-based metabolic modeling reveals that fatty acid oxidation (FAO) controls endothelial cell (EC) permeability. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 14, 621-634 (2015).
- Chowdhury, S. R., Djordjevic, J., Albensi, B. C., Fernyhough, P. Simultaneous evaluation of substrate-dependent oxygen consumption rates and mitochondrial membrane potential by TMRM and safranin in cortical mitochondria. Bioscience Reports. 36, e00286 (2015).
- Simonnet, H., Vigneron, A., Pouysségur, J. Conventional Techniques to Monitor Mitochondrial Oxygen Consumption. Methods in Enzymology. 542, 151-161 (2014).
- Martínez-Reyes, I., et al. TCA Cycle and Mitochondrial Membrane Potential Are Necessary for Diverse Biological Functions. Molecular Cell. 61, 199-209 (2016).
- Sukumar, M., et al. Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy. Cell Metabolism. 23, 63-76 (2016).
- Wundenberg, T., Grabinski, N., Lin, H., Mayr, G. W. Discovery of InsP6-kinases as InsP6-dephosphorylating enzymes provides a new mechanism of cytosolic InsP6 degradation driven by the cellular ATP/ADP ratio. The Biochemical Journal. 462, 173-184 (2014).
- Morciano, G., et al. Use of luciferase probes to measure ATP in living cells and animals. Nature Protocols. 12, 1542-1562 (2017).
- Chau, M. D. L., Gao, J., Yang, Q., Wu, Z., Gromada, J. Fibroblast growth factor 21 regulates energy metabolism by activating the AMPK-SIRT1-PGC-1alpha pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12553-12558 (2010).
- Lee, K. -. H., et al. Targeting energy metabolic and oncogenic signaling pathways in triple-negative breast cancer by a novel adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) activator. The Journal of Biological Chemistry. 286, 39247-39258 (2011).
- Godlewski, J., et al. MicroRNA-451 Regulates LKB1/AMPK Signaling and Allows Adaptation to Metabolic Stress in Glioma Cells. Molecular Cell. 37, 620-632 (2010).
- Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7, 1068-1085 (2012).
- Kaplon, J., et al. A key role for mitochondrial gatekeeper pyruvate dehydrogenase in oncogene-induced senescence. Nature. 498, 109-112 (2013).
- Pardee, T. S., et al. A phase I study of the first-in-class antimitochondrial metabolism agent, CPI-613, in patients with advanced hematologic malignancies. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 20, 5255-5264 (2014).
- Stein, M., et al. A defined metabolic state in pre B cells governs B-cell development and is counterbalanced by Swiprosin-2/EFhd1. Cell Death and Differentiation. 24, 1239-1252 (2017).
- Hrušák, O., Porwit-MacDonald, A. Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemias. Leukemia. 16, 1233-1258 (2002).
- Amin, H. M., et al. Having a higher blast percentage in circulation than bone marrow: clinical implications in myelodysplastic syndrome and acute lymphoid and myeloid leukemias. Leukemia. 19, 1567-1572 (2005).
