Évaluation du profil métabolique des cellules leucémiques primaires
Summary
Nous présentons ici un protocole pour l’isolement des cellules leucémiques de leucémie patients la moelle osseuse et l’analyse de leur état métabolique. Évaluation du profil métabolique des cellules leucémiques primaires pourrait aider à mieux caractériser la demande des cellules primaires et pourrait mener à une médecine plus personnalisée.
Abstract
L’exigence métabolique des cellules cancéreuses peut influencer négativement la survie et l’efficacité du traitement. De nos jours, ciblage pharmaceutique des voies métaboliques est testée dans plusieurs types de tumeurs. Ainsi, la caractérisation de l’installation métabolique de cellules du cancer est inévitable afin de cibler la bonne voie afin d’améliorer le résultat global des patients. Malheureusement, dans la majorité des cancers, les cellules malignes sont assez difficiles à obtenir en plus grand nombre et la biopsie de tissu est requise. La leucémie est une exception, où un nombre suffisant de cellules leucémiques peut être isolé dans la moelle osseuse. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l’isolement des cellules leucémiques de leucémie patients la moelle osseuse et l’analyse ultérieure de leur état métabolique avec analyseur de flux extracellulaire. Les cellules leucémiques sont isolés par le gradient de densité, ce qui n’altère pas leur validité. La prochaine étape de la culture aide à se régénérer, donc l’état métabolique mesuré est l’état des cellules dans des conditions optimales. Ce protocole permet d’obtenir des résultats cohérents et bien standardisées, qui pourraient être utilisées pour la thérapie personnalisée.
Introduction
Le profil métabolique est l’une des principales caractéristiques des cellules et bioénergétique altérée sont désormais considérés comme une des caractéristiques du cancer1,2,3. En outre, les changements dans les paramètres métaboliques pourraient servir dans le traitement du cancer en ciblant les voies de transduction de signal ou de la machinerie enzymatique de cancer des cellules4,5,6. Sachant la prédisposition métabolique des cellules cancéreuses est donc un avantage et peut aider à améliorer le traitement actuel.
Il y a une abondance de méthodes déjà éprouvées qui peuvent évaluer l’activité métabolique des cellules en culture. Au sujet de la glycolyse, l’absorption du glucose est mesurable par le marquage radioactif, à l’aide de 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) ou taux de lactate extracellulaire mesurée par voie enzymatique7,8. Taux d’oxydation de l’acide gras est un autre paramètre métabolique mesuré par palmitate isotopiquement étiquetés9,10. Taux de consommation d’oxygène est une méthode largement utilisée pour la détermination de l’activité mitochondriale dans les cellules11,12, ainsi que de la membrane mitochondriale potentiel évaluation13,14, ATP/ADP (adénosine Adénosine-triphosphate/5′ 5′-diphosphate) ratio mesure15 ou total intracellulaire ATP mesure16. Voies qui régulent les processus métaboliques de signalisation peut être déterminée par des analyses quantitatives de protéine et peut améliorer la compréhension des mesures métaboliques17,18,19.
Cependant, toutes ces méthodes mesurent seul ou, dans le meilleur scénario, quelques paramètres métaboliques dans un échantillon en même temps. Ce qui est important, la mesure simultanée des taux de consommation d’oxygène (OCR) et taux d’acidification extracellulaire (ECAR) est possible par l’analyse de flux extracellulaire par, par exemple, Seahorse XFp Analyzer. L’OCR est un indicateur de la respiration mitochondriale et ECAR est principalement le résultat de la glycolyse (nous ne pouvons ignorer le CO2 production élever éventuellement ECAR de cellules avec une activité élevée de la phosphorylation oxydative)20. Jusqu’ici, les divers types de cellules ont été étudiés en utilisant ces analyseurs21,22,23.
Nous décrivons ici le protocole pour l’analyse de flux extracellulaire de blastes primaires (cellules de la leucémie dérivés le stade hématopoïétique immature) de patients atteints de leucémie. Au meilleur de notre connaissance, un protocole spécifique Blasts primaire n’est pas disponible encore.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ci-dessus permet la mesure de l’activité métabolique évaluée par OCR et ECAR valeurs dans les blastes leucémiques primaires provenant de patients atteints de leucémie lymphoblastique aiguë (LLA) ou leucémie myéloïde aiguë (LMA). L’avantage de la mesure à l’aide d’un analyseur de flux extracellulaire, c’est qu’il permet la détection du profil métabolique dans le temps réel dans les cellules vivantes. Essentiellement, toutes les étapes du protocole fourni pourraient être aj…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier les centres d’hématologie pédiatrique tchèque. Ce travail a été soutenu par la subvention du ministère de la santé (NV15-28848A), ministère de la santé de l’Université l’hôpital Motol, République tchèque, Prague, République tchèque 00064203 et par le ministère de l’éducation, jeunesse et Sports NPU I nr. LO1604.
Materials
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco, ThermoFisher Scientific | 61870-010 | |
| Fetal Bovine Serum | Biosera | FB-1001/100 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15240-062 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
| Oligomycin A | Sigma-Aldrich | 75351-5MG | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375-1G | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920-10MG | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875-1G | |
| Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674-25MG | |
| Seahorse XF Base Medium, 100 mL | Agilent Technologies | 103193-100 | |
| L-glutamine solution, 200 mM | Sigma-Aldrich | G7513-100ML | |
| HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6 | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-25G | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153-10G | |
| Ficoll-Paque Plus | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 | Density gradient medium |
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent Technologies | 103022-100 | |
| Corning™ Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | CB40240 | |
| Seahorse Analyzer XFp | Agilent Technologies | S7802A | |
| Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 |
Referências
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