הערכה של פרופיל מטבולי של תאי סרטן ראשוני
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול בידודו של תאים לוקמיה במח העצם חולי לוקמיה וניתוח של מדינתם מטבולית. הערכה של פרופיל מטבולי של תאי סרטן ראשוני יכול לעזור כדי לאפיין טוב יותר את הביקוש של ראשי תאים, עלול להוביל רפואה אישית יותר.
Abstract
הדרישה המטבולית של תאים סרטניים יכולים להשפיע באופן שלילי על הישרדות, יעילות הטיפול. כיום, פילוח התרופות של מסלולים מטבוליים נבחנה סוגים רבים של גידולים. לפיכך, אפיון של סרטן תאים ההתקנה מטבולית בלתי נמנע כדי למקד את השביל הנכון כדי לשפר את התוצאה הכוללת של חולים. למרבה הצער, ברוב סוגי סרטן, שהתאים הממאירים הם די קשה להשיג במספרים גבוהים יותר, נדרשת ביופסיה רקמות. לוקמיה היא יוצאת דופן, שבו מספר מספיק של תאים לוקמיה ניתן לבודד ממח העצם. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט בידודו של תאים לוקמיה במח העצם חולי לוקמיה וניתוח הבאים של מצב מטבולי שלהם באמצעות מנתח השטף חוץ-תאית. תאים לוקמיה מבודדות על-ידי מעבר הצבע צפיפות, אשר אינה משפיעה על יכולת הקיום שלהם. השלב הבא בטיפוח מסייעת להם להתחדש, ובכך המדינה מטבולית נמדד מצבו של תאים בתנאים אופטימליים. פרוטוקול זה מאפשר בהשגת תוצאות עקביות, מתוקננת היטב, אשר יכול לשמש עבור הטיפול אישית.
Introduction
פרופיל מטבולי הוא אחד המאפיינים העיקריים של תאים, ביואנרגיה שינו עכשיו נחשבים לאחד גולת הכותרת של סרטן1,2,3. יתר על כן, שינויים בהגדרת מטבולית יכול לשמש לטיפול בסרטן על ידי מיקוד האות התמרה חושית מסלולים או מכונות אנזימטי של סרטן תאים4,5,6. בידיעה חילוף לנטייה של תאים סרטניים ולכן יש יתרון והוא יכול לעזור לשפר את הטיפול הנוכחי.
ישנן הרבה שיטות שכבר פועלת אשר יכול להעריך את הפעילות המטבולית של תאים בתרבות. לגבי גליקוליזה, ספיגת הגלוקוז נמדד על ידי תיוג רדיואקטיבי, באמצעות 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) או רמת חומצת החלב חוץ-תאית נמדד enzymatically7,8. קצב חמצון חומצות שומן הינו פרמטר נוסף מטבולית נמדדת פלמיתד שכותרתו isotopically9,10. קצב צריכת החמצן היא שיטה נפוץ לקביעת פעילות מיטוכונדריאלי בתאים11,12, יחד עם ממברנה מיטוכונדריאלי פוטנציאליים הערכה13,14, ATP/ADP (אדנוזין יונקות-טריפוספט/אדנוזין יונקות-diphosphate) יחס מידה15 או סך תאיים ATP מידה16. איתות המסלולים הידועים כדי לווסת את תהליכי חילוף החומרים יכול להיקבע על ידי חלבון quantifications, יכול לשפר את ההבנה של מדידות מטבולית17,18,19.
אולם, כל השיטות האלה למדוד רק אחת או, בתרחיש הטוב ביותר, מספר פרמטרים מטבולית אחד לטעום בו זמנית. חשוב, בו זמנית מדידה של קצב צריכת החמצן (OCR) וקצב חוץ-תאית acidification (ECAR) יכולה להיות מושגת על ידי הניתוח השטף חוץ-תאית על ידי, לדוגמה, סוסון ים XFp מנתח. OCR הוא מחוון של הנשימה מיטוכונדריאלי, ECAR היא בעיקר התוצאה של גליקוליזה (אי אפשר להתעלם CO2 הפקה ואולי היא מרוממת ECAR של תאים עם פעילות גבוהה זרחון חמצוני)20. עד כה, סוגי תאים שונים נחקרו באמצעות אלה מנתחי21,22,23.
כאן נתאר הפרוטוקול עבור ניתוח חוץ-תאית השטף של תקיעות הראשי (תאים לוקמיה נגזר מן השלב hematopoietic ילדותי) של חולי לוקמיה. לפי מיטב ידיעתנו, פרוטוקול ספציפי עבור תקיעות הראשי אינו זמין עדיין.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר לעיל מאפשר מדידת פעילות חילוף החומרים מוערך על ידי ערכים OCR, ECAR העיקרית בפיצוצים לוקמיה נגזר חולים עם לוקמיה לימפובלסטית חריפה (ALL) או לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML). היתרון של מדידה באמצעות מנתח השטף חוץ-תאית הוא שהם מאפשרים זיהוי פרופיל מטבולי בזמן אמת בתאים חיים. בעיקרו של ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות המרכזים המטולוגיה לילדים הצ’כית. עבודה זו היה נתמך על ידי מענק של משרד הבריאות (NV15-28848A), על ידי משרד הבריאות של הרפובליקה הצ’כית, אוניברסיטת בית החולים במוטול, פראג, הרפובליקה הצ’כית 00064203 ועל ידי משרד החינוך, נוער, ספורט NPU אני נ. LO1604.
Materials
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco, ThermoFisher Scientific | 61870-010 | |
| Fetal Bovine Serum | Biosera | FB-1001/100 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15240-062 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
| Oligomycin A | Sigma-Aldrich | 75351-5MG | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375-1G | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920-10MG | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875-1G | |
| Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674-25MG | |
| Seahorse XF Base Medium, 100 mL | Agilent Technologies | 103193-100 | |
| L-glutamine solution, 200 mM | Sigma-Aldrich | G7513-100ML | |
| HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6 | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-25G | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153-10G | |
| Ficoll-Paque Plus | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 | Density gradient medium |
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent Technologies | 103022-100 | |
| Corning™ Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | CB40240 | |
| Seahorse Analyzer XFp | Agilent Technologies | S7802A | |
| Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 |
Referências
- DeBerardinis, R. J., Lum, J. J., Hatzivassiliou, G., Thompson, C. B. The Biology of Cancer: Metabolic Reprogramming Fuels Cell Growth and Proliferation. Cell Metabolism. 7, 11-20 (2008).
- Ward, P. S., Thompson, C. B. Metabolic Reprogramming: A Cancer Hallmark Even Warburg Did Not Anticipate. Cancer Cell. 21, 297-308 (2012).
- Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism. Cell Metabolism. 23, 27-47 (2016).
- Wise, D. R., Thompson, C. B. Glutamine addiction: a new therapeutic target in cancer. Trends in Biochemical Sciences. 35, 427-433 (2010).
- Kroemer, G., Pouyssegur, J. Tumor Cell Metabolism: Cancer’s Achilles’ Heel. Cancer Cell. 13, 472-482 (2008).
- Liberti, M. V., et al. A Predictive Model for Selective Targeting of the Warburg Effect through GAPDH Inhibition with a Natural Product. Cell Metabolism. 26, 648-659 (2017).
- Lundgaard, I., et al. Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism. Nature Communications. 6, 6807 (2015).
- Hermanova, I., et al. Pharmacological inhibition of fatty-acid oxidation synergistically enhances the effect of l-asparaginase in childhood ALL cells. Leukemia. 30, 209-218 (2016).
- Malandrino, M. I., et al. Enhanced fatty acid oxidation in adipocytes and macrophages reduces lipid-induced triglyceride accumulation and inflammation. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308, E756-E769 (2015).
- Patella, F., et al. Proteomics-based metabolic modeling reveals that fatty acid oxidation (FAO) controls endothelial cell (EC) permeability. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 14, 621-634 (2015).
- Chowdhury, S. R., Djordjevic, J., Albensi, B. C., Fernyhough, P. Simultaneous evaluation of substrate-dependent oxygen consumption rates and mitochondrial membrane potential by TMRM and safranin in cortical mitochondria. Bioscience Reports. 36, e00286 (2015).
- Simonnet, H., Vigneron, A., Pouysségur, J. Conventional Techniques to Monitor Mitochondrial Oxygen Consumption. Methods in Enzymology. 542, 151-161 (2014).
- Martínez-Reyes, I., et al. TCA Cycle and Mitochondrial Membrane Potential Are Necessary for Diverse Biological Functions. Molecular Cell. 61, 199-209 (2016).
- Sukumar, M., et al. Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy. Cell Metabolism. 23, 63-76 (2016).
- Wundenberg, T., Grabinski, N., Lin, H., Mayr, G. W. Discovery of InsP6-kinases as InsP6-dephosphorylating enzymes provides a new mechanism of cytosolic InsP6 degradation driven by the cellular ATP/ADP ratio. The Biochemical Journal. 462, 173-184 (2014).
- Morciano, G., et al. Use of luciferase probes to measure ATP in living cells and animals. Nature Protocols. 12, 1542-1562 (2017).
- Chau, M. D. L., Gao, J., Yang, Q., Wu, Z., Gromada, J. Fibroblast growth factor 21 regulates energy metabolism by activating the AMPK-SIRT1-PGC-1alpha pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12553-12558 (2010).
- Lee, K. -. H., et al. Targeting energy metabolic and oncogenic signaling pathways in triple-negative breast cancer by a novel adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) activator. The Journal of Biological Chemistry. 286, 39247-39258 (2011).
- Godlewski, J., et al. MicroRNA-451 Regulates LKB1/AMPK Signaling and Allows Adaptation to Metabolic Stress in Glioma Cells. Molecular Cell. 37, 620-632 (2010).
- Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7, 1068-1085 (2012).
- Kaplon, J., et al. A key role for mitochondrial gatekeeper pyruvate dehydrogenase in oncogene-induced senescence. Nature. 498, 109-112 (2013).
- Pardee, T. S., et al. A phase I study of the first-in-class antimitochondrial metabolism agent, CPI-613, in patients with advanced hematologic malignancies. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 20, 5255-5264 (2014).
- Stein, M., et al. A defined metabolic state in pre B cells governs B-cell development and is counterbalanced by Swiprosin-2/EFhd1. Cell Death and Differentiation. 24, 1239-1252 (2017).
- Hrušák, O., Porwit-MacDonald, A. Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemias. Leukemia. 16, 1233-1258 (2002).
- Amin, H. M., et al. Having a higher blast percentage in circulation than bone marrow: clinical implications in myelodysplastic syndrome and acute lymphoid and myeloid leukemias. Leukemia. 19, 1567-1572 (2005).
