Vurdering av metabolske profilen til primære leukemi celler
Summary
Her presenterer vi en protokoll for isolering av leukemic celler fra leukemi pasienter benmargen og analyse av deres metabolske tilstand. Vurdering av metabolske profilen til primære leukemi celler kan bidra til å bedre karakterisere etterspørselen av primære celler og føre til mer personlig medisin.
Abstract
Metabolske behovet av kreftceller kan negativt påvirke overlevelse og behandling effekt. I dag, er farmasøytiske målretting av metabolske veier testet i mange typer av svulst. Dermed er karakteristikk av kreft cellen metabolske oppsett uunngåelig for å målrette den riktige veien for å øke det samlede resultatet av pasienter. Dessverre, i de fleste av kreft, ondartet cellene er ganske vanskelig å få tak i høyere tall og vev biopsi er nødvendig. Leukemi er et unntak, der et tilstrekkelig antall leukemic celler kan isoleres fra benmargen. Her gir vi en detaljert protokoll for isolering av leukemic celler fra leukemi pasienter benmargen og påfølgende analyse av sine metabolske staten ved hjelp av ekstracellulære flux analyzer. Leukemic celler er isolert av tetthet gradient, hvilke ikke påvirker sin levedyktighet. Neste dyrking trinn hjelper dem å regenerere, dermed metabolske staten målt er celler under optimale forhold. Denne protokollen tillater å oppnå konsistente, godt standardisert resultater, som kan brukes for personlig terapi.
Introduction
Metabolsk profilen er en av de viktigste egenskapene av celler og endret bioenergi er nå regnet som en av kjennetegnene kreft1,2,3. Videre kan endringer i metabolske oppsettet brukes i behandling av kreft ved å målrette signaltransduksjon trasé eller enzymatisk maskiner kreft celler4,5,6. Å vite den metabolske predisposisjon av kreftceller er således en fordel og kan forbedre gjeldende terapi.
Det er en masse allerede etablerte metoder som kan vurdere metabolske aktiviteten til cellene i kultur. Om Glykolysen, glukose opptak kan måles ved radioaktivt merkingen, med 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) eller ekstracellulær laktat nivåer målt enzymatisk7,8. Fettsyrer er oksidasjon en annen metabolske parameter målt ved isotopically merket palmitate9,10. Oksygen forbruksraten er en metode mye brukt for å bestemme mitokondrie aktivitet i cellene11,12, sammen med de mitokondrie membran potensielle evaluering13,14, ATP/ADP (adenosin 5 ‘-trifosfat/5 ‘-adenosindifosfat) forholdet måling15 eller totalt intracellulær ATP måling16. Signalnettverk trasé kjent for å regulere metabolske prosesser kan bestemmes av protein quantifications og kan forbedre forståelsen av metabolske målinger17,18,19.
Men alle disse metodene mål bare ett, eller inne det best filmmanuskriptet, noen metabolske parametere i en prøve samtidig. Viktigere, kan samtidig måling av oksygen forbruksraten (OCR) og ekstracellulære forsuring rate (ECAR) oppnås ved ekstracellulære flux analysen av, for eksempel Seahorse XFp Analyzer. OCR er en indikator på mitokondrie åndedrett og ECAR skyldes hovedsakelig Glykolysen (vi ikke kan overse CO2 produksjon muligens heve ECAR celler med høy oxidative fosforylering aktivitet)20. Så langt, har ulike celletyper studert ved bruk av disse analyserer21,22,23.
Her beskriver vi protokollen for ekstracellulære flux analyse av primære eksplosjonene (leukemi celler avledet fra umodne blodkreft scenen) fra leukemi pasienter. Best av vår kunnskap er en bestemt protokoll for primære eksplosjonene ikke tilgjengelig ennå.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ovenfor beskrevet protokollen tillater for måling av metabolske aktiviteten vurdert av OCR og ECAR verdier i primære leukemic støt fra pasienter med akutt lymfatisk leukemi (alle) eller akutt myelogen leukemi (AML). Fordelen med måling ved hjelp av en ekstracellulære flux analyserer er at den lar påvisning av metabolske profil i sanntid i live cellene. Hovedsak kan alle trinn i angitte protokollen justeres avhengig celle man planlegger å studere. Her vil vi diskutere de viktigste parameterne som kan påvirke resul…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi ønsker å takke den tsjekkiske Pediatric hematologi sentre. Dette arbeidet var støttet av Grant av Helsedepartementet (NV15-28848A), av Helsedepartementet av Tsjekkia, University Hospital Motol, Prague, Tsjekkia 00064203 og departementet for utdanning, ungdom og sport NPU jeg nr. LO1604.
Materials
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco, ThermoFisher Scientific | 61870-010 | |
| Fetal Bovine Serum | Biosera | FB-1001/100 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15240-062 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
| Oligomycin A | Sigma-Aldrich | 75351-5MG | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375-1G | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920-10MG | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875-1G | |
| Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674-25MG | |
| Seahorse XF Base Medium, 100 mL | Agilent Technologies | 103193-100 | |
| L-glutamine solution, 200 mM | Sigma-Aldrich | G7513-100ML | |
| HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6 | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-25G | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153-10G | |
| Ficoll-Paque Plus | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 | Density gradient medium |
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent Technologies | 103022-100 | |
| Corning™ Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | CB40240 | |
| Seahorse Analyzer XFp | Agilent Technologies | S7802A | |
| Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 |
Referências
- DeBerardinis, R. J., Lum, J. J., Hatzivassiliou, G., Thompson, C. B. The Biology of Cancer: Metabolic Reprogramming Fuels Cell Growth and Proliferation. Cell Metabolism. 7, 11-20 (2008).
- Ward, P. S., Thompson, C. B. Metabolic Reprogramming: A Cancer Hallmark Even Warburg Did Not Anticipate. Cancer Cell. 21, 297-308 (2012).
- Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism. Cell Metabolism. 23, 27-47 (2016).
- Wise, D. R., Thompson, C. B. Glutamine addiction: a new therapeutic target in cancer. Trends in Biochemical Sciences. 35, 427-433 (2010).
- Kroemer, G., Pouyssegur, J. Tumor Cell Metabolism: Cancer’s Achilles’ Heel. Cancer Cell. 13, 472-482 (2008).
- Liberti, M. V., et al. A Predictive Model for Selective Targeting of the Warburg Effect through GAPDH Inhibition with a Natural Product. Cell Metabolism. 26, 648-659 (2017).
- Lundgaard, I., et al. Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism. Nature Communications. 6, 6807 (2015).
- Hermanova, I., et al. Pharmacological inhibition of fatty-acid oxidation synergistically enhances the effect of l-asparaginase in childhood ALL cells. Leukemia. 30, 209-218 (2016).
- Malandrino, M. I., et al. Enhanced fatty acid oxidation in adipocytes and macrophages reduces lipid-induced triglyceride accumulation and inflammation. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308, E756-E769 (2015).
- Patella, F., et al. Proteomics-based metabolic modeling reveals that fatty acid oxidation (FAO) controls endothelial cell (EC) permeability. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 14, 621-634 (2015).
- Chowdhury, S. R., Djordjevic, J., Albensi, B. C., Fernyhough, P. Simultaneous evaluation of substrate-dependent oxygen consumption rates and mitochondrial membrane potential by TMRM and safranin in cortical mitochondria. Bioscience Reports. 36, e00286 (2015).
- Simonnet, H., Vigneron, A., Pouysségur, J. Conventional Techniques to Monitor Mitochondrial Oxygen Consumption. Methods in Enzymology. 542, 151-161 (2014).
- Martínez-Reyes, I., et al. TCA Cycle and Mitochondrial Membrane Potential Are Necessary for Diverse Biological Functions. Molecular Cell. 61, 199-209 (2016).
- Sukumar, M., et al. Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy. Cell Metabolism. 23, 63-76 (2016).
- Wundenberg, T., Grabinski, N., Lin, H., Mayr, G. W. Discovery of InsP6-kinases as InsP6-dephosphorylating enzymes provides a new mechanism of cytosolic InsP6 degradation driven by the cellular ATP/ADP ratio. The Biochemical Journal. 462, 173-184 (2014).
- Morciano, G., et al. Use of luciferase probes to measure ATP in living cells and animals. Nature Protocols. 12, 1542-1562 (2017).
- Chau, M. D. L., Gao, J., Yang, Q., Wu, Z., Gromada, J. Fibroblast growth factor 21 regulates energy metabolism by activating the AMPK-SIRT1-PGC-1alpha pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12553-12558 (2010).
- Lee, K. -. H., et al. Targeting energy metabolic and oncogenic signaling pathways in triple-negative breast cancer by a novel adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) activator. The Journal of Biological Chemistry. 286, 39247-39258 (2011).
- Godlewski, J., et al. MicroRNA-451 Regulates LKB1/AMPK Signaling and Allows Adaptation to Metabolic Stress in Glioma Cells. Molecular Cell. 37, 620-632 (2010).
- Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7, 1068-1085 (2012).
- Kaplon, J., et al. A key role for mitochondrial gatekeeper pyruvate dehydrogenase in oncogene-induced senescence. Nature. 498, 109-112 (2013).
- Pardee, T. S., et al. A phase I study of the first-in-class antimitochondrial metabolism agent, CPI-613, in patients with advanced hematologic malignancies. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 20, 5255-5264 (2014).
- Stein, M., et al. A defined metabolic state in pre B cells governs B-cell development and is counterbalanced by Swiprosin-2/EFhd1. Cell Death and Differentiation. 24, 1239-1252 (2017).
- Hrušák, O., Porwit-MacDonald, A. Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemias. Leukemia. 16, 1233-1258 (2002).
- Amin, H. M., et al. Having a higher blast percentage in circulation than bone marrow: clinical implications in myelodysplastic syndrome and acute lymphoid and myeloid leukemias. Leukemia. 19, 1567-1572 (2005).
