Avaliação do perfil metabólico das células de leucemia primária
Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para análise de seu estado metabólico e o isolamento de células leucêmicas da medula óssea de pacientes de leucemia. Avaliação do perfil metabólico das células de leucemia primária poderia contribuir para melhor caracterizar a demanda de células primárias e poderia levar a medicina mais personalizada.
Abstract
A exigência metabólica das células cancerosas pode influenciar negativamente, sobrevivência e a eficácia do tratamento. Hoje em dia, orientação farmacêutica das vias metabólicas é testado em muitos tipos de tumores. Assim, a caracterização de configuração metabólica de célula de câncer é inevitável fim de direcionar o caminho correto para melhorar o resultado global dos pacientes. Infelizmente, na maioria dos tipos de câncer, as células malignas são muito difíceis de obter em números mais altos e a biópsia do tecido é necessária. A leucemia é uma exceção, onde um número suficiente de células leucêmicas pode ser isolado da medula óssea. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento de células leucêmicas da medula óssea de pacientes de leucemia e posterior análise de seu estado metabólico, usando o analisador de fluxo extracelular. Células leucêmicas são isoladas pelo gradiente de densidade, que não afeta a sua viabilidade. O próximo passo de cultivo ajuda a regenerar, assim, o estado metabólico medido é o estado das células em condições ideais. Este protocolo permite alcançar resultados consistentes, bem padronizados, que poderiam ser usados para a terapia personalizada.
Introduction
O perfil metabólico é uma das principais características das células e bioenergética alterada são consideradas uma das marcas de câncer1,2,3. Além disso, alterações na configuração da metabólica poderiam ser usadas no tratamento de câncer pela segmentação vias de transdução de sinal ou maquinaria enzimática de células de câncer a4,5,6. Conhecendo a predisposição metabólica das células cancerosas é, assim, uma vantagem e pode ajudar a melhorar a terapia atual.
Há uma abundância de métodos já estabelecidos que pode avaliar a atividade metabólica das células em cultura. Em relação a glicólise, a absorção de glicose pode ser medida pela rotulagem radioactiva, usando 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) ou níveis de lactato extracelular mensurados enzimaticamente7,8. Taxa de oxidação de ácidos graxos é outro parâmetro metabólico medido por desvendar rotulado palmitato9,10. Taxa de consumo de oxigênio é um método utilizado para determinar a actividade mitocondrial em células11,12, juntamente com a membrana mitocondrial potencial avaliação13,14, ATP/ADP (adenosina 5 ‘-trifosfato/adenosina 5 ‘-difosfato) relação medição15 ou total intracelular ATP medição16. Sinalização de caminhos conhecidos por regulam processos metabólicos pode ser determinada por quantificações de proteínas e pode melhorar a compreensão das medições metabólicas17,18,19.
No entanto, todos esses métodos medem apenas uma ou, no melhor cenário, alguns parâmetros metabólicos em uma amostra simultaneamente. Importante, medição simultânea da taxa de consumo de oxigênio (OCR) e taxa de acidificação do extracelular (ECAR) pode ser alcançada através da análise de fluxo extracelular por, por exemplo, cavalos-marinhos XFp Analyzer. OCR é um indicador da respiração mitocondrial e ECAR resulta principalmente da glicólise (que não podemos ignorar o CO2 produção possivelmente elevando ECAR de células com atividade alta fosforilação oxidativa)20. Até agora, vários tipos de células têm sido estudados usando estes analisadores21,22,23.
Aqui descrevemos o protocolo para a análise de fluxo extracelular primário blastos (células de leucemia derivadas o estágio imaturo hematopoiético) de pacientes de leucemia. O melhor de nosso conhecimento, um protocolo específico para explosões primários não está disponível ainda.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo acima descrita permite a medição da atividade metabólica avaliada por valores de OCR e ECAR no primários leucêmicas explosões derivadas de pacientes com leucemia linfoblástica aguda (LLA) ou leucemia mieloide aguda (LMA). A vantagem de medição utilizando um analisador de fluxo extracelular é que permite a detecção de perfil metabólico no tempo real nas células vivas. Essencialmente, cada passo no protocolo fornecido pode ser ajustado dependendo do tipo de célula, um planeja estudar. Aqui, vamos…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a centros de Hematologia pediátrica Checa. Este trabalho foi apoiado por Grant do Ministério da saúde (NV15-28848A), pelo Ministério da saúde da República Checa, University Hospital Motol, Praga, República Checa 00064203 e pelo Ministério da educação, da juventude e desportos NPU eu nr. LO1604.
Materials
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco, ThermoFisher Scientific | 61870-010 | |
| Fetal Bovine Serum | Biosera | FB-1001/100 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15240-062 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
| Oligomycin A | Sigma-Aldrich | 75351-5MG | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375-1G | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920-10MG | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875-1G | |
| Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674-25MG | |
| Seahorse XF Base Medium, 100 mL | Agilent Technologies | 103193-100 | |
| L-glutamine solution, 200 mM | Sigma-Aldrich | G7513-100ML | |
| HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6 | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-25G | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153-10G | |
| Ficoll-Paque Plus | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 | Density gradient medium |
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent Technologies | 103022-100 | |
| Corning™ Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | CB40240 | |
| Seahorse Analyzer XFp | Agilent Technologies | S7802A | |
| Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 |
Referências
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