Birincil lösemi hücrelerinin metabolik profili değerlendirilmesi
Summary
Burada bir protokol lösemi hastalarında kemik iliği lösemik hücrelerin izolasyonu ve metabolik durumlarına analizi için mevcut. Birincil lösemi hücrelerinin metabolik profili değerlendirilmesi daha iyi primer hücre talep karakterize etmek için yardımcı olabilir ve daha fazla kişiselleştirilmiş tıp neden olabilir.
Abstract
Kanser hücrelerinin metabolik gereksinimi hayatta kalma ve tedavi etkinliği olumsuz yönde etkileyebilir. Günümüzde, ilaç metabolik yollar hedefleme tümörler birçok türde sınanır. Böylece, kanser hücre metabolik Kur karakterizasyonu, hastaların genel sonucunu iyileştirmek için doğru yolu hedeflemek için kaçınılmazdır. Ne yazık ki, kanserlerin çoğunluğu, kötü huylu hücreleri daha yüksek miktarlarda elde etmek oldukça zordur ve doku biyopsisi gereklidir. Lösemi bir istisnadır, nerede lösemik hücreler yeterli sayıda kemik iliği ayrılmış olabilir. Burada, biz lösemi hastalarında kemik iliği lösemik hücrelerin izolasyonu ve metabolik durumlarına ekstraselüler akı Çözümleyicisi’ni kullanarak, daha sonraki analiz için detaylı bir protokol sağlar. Lösemik hücre canlılığı etkilemez yoğunluk gradient tarafından yalıtılır. Ekimi bir adım onları yeniden oluşturmak için yardımcı olur, böylece ölçülen metabolik durum optimal koşullar hücrelerde durumudur. Bu iletişim kuralı için kişiselleştirilmiş terapi kullanılabilir tutarlı, iyi standart sonuçlar elde sağlar.
Introduction
Metabolik hücreler ana özelliklerinden biri olması ve değiştirilmiş bioenergetics şimdi kanser1,2,3işaretlerinden biri kabul edilir. Ayrıca, metabolik Kur değişiklikleri sinyal iletim yollarının veya kanser hücreleri4,5,6enzimatik makine hedefleyerek kanser tedavisinde kullanılan. Kanser hücrelerinin metabolik yatkınlık bilmek böylece bir avantajdır ve geçerli terapi artırmaya yardımcı olabilir.
Bir çok sayıda hücre kültüründe metabolik etkinliğini değerlendirmek zaten kurulmuş yöntemler vardır. Glikoliz ile ilgili, Glikoz alımı ölçülebilir radyoaktif etiketleme tarafından 2-NBDG kullanarak (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) veya hücre dışı laktat seviyeleri ölçülen enzimatik7,8. Başka bir metabolik parametre isotopically etiketli palmiat9,10tarafından ölçülen yağ asidi oksidasyon oranıdır. Oksijen tüketim oranını hücreleri11,12‘ mitokondrial membran potansiyeli değerlendirme13,14, ATP/ADP (adenozin birlikte mitokondrial etkinliği belirlemek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir 5 ‘-trifosfat/Adenozin 5 ‘-nükleotittir) oranı ölçümü15 veya toplam hücre içi ATP ölçümü16. Metabolik süreçleri düzenleyen bilinen yolları sinyal protein quantifications tarafından belirlenen ve metabolik ölçüleri17,18,19anlayış artırabilirsiniz.
Ancak, tüm bu yöntemler sadece bir tedbir veya en iyi senaryoda, aynı anda birkaç metabolik parametreleri bir örnek. Önemlisi, eş zamanlı ölçüm oksijen tüketim oranını (OCR) ve ekstraselüler asitleştirme oranı (D.H.T.) göre örneğin, deniz atı XFp Analyzer ekstraselüler akı analiz elde edilebilir. OCR mitokondrial solunum bir göstergesidir ve D.H.T. ağırlıklı olarak (biz CO2 üretim muhtemelen D.H.T. hücrelerinin yüksek Oksidatif fosforilasyon aktivite ile yükselen görmezden değil) glikoliz sonucu20. Şimdiye kadar çeşitli hücre tiplerinin bu Analizörleri21,22,23kullanılarak incelenmiştir.
Burada lösemi hastalarına Protokolü birincil patlamaların (olgunlaşmamış hematopoetik sahne alanı’ndan elde edilen lösemi hücreleri) hücre dışı akı analizi için açıklamak. Bizim bilgi en iyi şekilde, belirli bir iletişim kuralı birincil patlamaların henüz kullanılabilir değil.
Protocol
Representative Results
Discussion
Akut lenfoblastik lösemi (ALL) ile hastalardan elde edilen birincil lösemik patlamaların OCR ve D.H.T. değerleri tarafından değerlendirildi metabolik aktivite ölçümü için yukarıda açıklanan protokolü sağlar veya akut miyeloid lösemi (AML). Bir hücre dışı akı çözümleyicisini kullanarak ölçüm gerçek zamanlı canlı hücrelerdeki metabolik profili tespiti sağlar avantajdır. Esasen, her adımda sağlanan iletişim kuralı bir çalışma planları hücre türüne bağlı olarak ayarlanmış olab…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çek Pediatrik Hematoloji merkezleri teşekkür etmek istiyorum. Bu eser yapıldı tarafından desteklenen Grant, Sağlık Bakanlığı (NV15-28848A), Sağlık Bakanlığı Çek Cumhuriyeti, Prag, Çek Cumhuriyeti 00064203 Üniversitesi Hastanesi konuşlanmıştır ve Milli Eğitim Bakanlığı, gençlik ve spor NPU tarafından ben nr. LO1604.
Materials
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco, ThermoFisher Scientific | 61870-010 | |
| Fetal Bovine Serum | Biosera | FB-1001/100 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15240-062 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
| Oligomycin A | Sigma-Aldrich | 75351-5MG | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375-1G | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920-10MG | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875-1G | |
| Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674-25MG | |
| Seahorse XF Base Medium, 100 mL | Agilent Technologies | 103193-100 | |
| L-glutamine solution, 200 mM | Sigma-Aldrich | G7513-100ML | |
| HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6 | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-25G | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153-10G | |
| Ficoll-Paque Plus | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 | Density gradient medium |
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent Technologies | 103022-100 | |
| Corning™ Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | CB40240 | |
| Seahorse Analyzer XFp | Agilent Technologies | S7802A | |
| Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 |
Referências
- DeBerardinis, R. J., Lum, J. J., Hatzivassiliou, G., Thompson, C. B. The Biology of Cancer: Metabolic Reprogramming Fuels Cell Growth and Proliferation. Cell Metabolism. 7, 11-20 (2008).
- Ward, P. S., Thompson, C. B. Metabolic Reprogramming: A Cancer Hallmark Even Warburg Did Not Anticipate. Cancer Cell. 21, 297-308 (2012).
- Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism. Cell Metabolism. 23, 27-47 (2016).
- Wise, D. R., Thompson, C. B. Glutamine addiction: a new therapeutic target in cancer. Trends in Biochemical Sciences. 35, 427-433 (2010).
- Kroemer, G., Pouyssegur, J. Tumor Cell Metabolism: Cancer’s Achilles’ Heel. Cancer Cell. 13, 472-482 (2008).
- Liberti, M. V., et al. A Predictive Model for Selective Targeting of the Warburg Effect through GAPDH Inhibition with a Natural Product. Cell Metabolism. 26, 648-659 (2017).
- Lundgaard, I., et al. Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism. Nature Communications. 6, 6807 (2015).
- Hermanova, I., et al. Pharmacological inhibition of fatty-acid oxidation synergistically enhances the effect of l-asparaginase in childhood ALL cells. Leukemia. 30, 209-218 (2016).
- Malandrino, M. I., et al. Enhanced fatty acid oxidation in adipocytes and macrophages reduces lipid-induced triglyceride accumulation and inflammation. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308, E756-E769 (2015).
- Patella, F., et al. Proteomics-based metabolic modeling reveals that fatty acid oxidation (FAO) controls endothelial cell (EC) permeability. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 14, 621-634 (2015).
- Chowdhury, S. R., Djordjevic, J., Albensi, B. C., Fernyhough, P. Simultaneous evaluation of substrate-dependent oxygen consumption rates and mitochondrial membrane potential by TMRM and safranin in cortical mitochondria. Bioscience Reports. 36, e00286 (2015).
- Simonnet, H., Vigneron, A., Pouysségur, J. Conventional Techniques to Monitor Mitochondrial Oxygen Consumption. Methods in Enzymology. 542, 151-161 (2014).
- Martínez-Reyes, I., et al. TCA Cycle and Mitochondrial Membrane Potential Are Necessary for Diverse Biological Functions. Molecular Cell. 61, 199-209 (2016).
- Sukumar, M., et al. Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy. Cell Metabolism. 23, 63-76 (2016).
- Wundenberg, T., Grabinski, N., Lin, H., Mayr, G. W. Discovery of InsP6-kinases as InsP6-dephosphorylating enzymes provides a new mechanism of cytosolic InsP6 degradation driven by the cellular ATP/ADP ratio. The Biochemical Journal. 462, 173-184 (2014).
- Morciano, G., et al. Use of luciferase probes to measure ATP in living cells and animals. Nature Protocols. 12, 1542-1562 (2017).
- Chau, M. D. L., Gao, J., Yang, Q., Wu, Z., Gromada, J. Fibroblast growth factor 21 regulates energy metabolism by activating the AMPK-SIRT1-PGC-1alpha pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12553-12558 (2010).
- Lee, K. -. H., et al. Targeting energy metabolic and oncogenic signaling pathways in triple-negative breast cancer by a novel adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) activator. The Journal of Biological Chemistry. 286, 39247-39258 (2011).
- Godlewski, J., et al. MicroRNA-451 Regulates LKB1/AMPK Signaling and Allows Adaptation to Metabolic Stress in Glioma Cells. Molecular Cell. 37, 620-632 (2010).
- Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7, 1068-1085 (2012).
- Kaplon, J., et al. A key role for mitochondrial gatekeeper pyruvate dehydrogenase in oncogene-induced senescence. Nature. 498, 109-112 (2013).
- Pardee, T. S., et al. A phase I study of the first-in-class antimitochondrial metabolism agent, CPI-613, in patients with advanced hematologic malignancies. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 20, 5255-5264 (2014).
- Stein, M., et al. A defined metabolic state in pre B cells governs B-cell development and is counterbalanced by Swiprosin-2/EFhd1. Cell Death and Differentiation. 24, 1239-1252 (2017).
- Hrušák, O., Porwit-MacDonald, A. Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemias. Leukemia. 16, 1233-1258 (2002).
- Amin, H. M., et al. Having a higher blast percentage in circulation than bone marrow: clinical implications in myelodysplastic syndrome and acute lymphoid and myeloid leukemias. Leukemia. 19, 1567-1572 (2005).
