Co-immunoprecipitation Assay voor het bestuderen van functionele interacties tussen receptoren en enzymen
Summary
Hier presenteren we een protocol voor co-immunoprecipitation en een op-kraal enzymatische activiteit assay gelijktijdig het bestuderen van de bijdrage van specifieke proteïne domeinen van plasmamembraan receptoren aan zowel de enzym werving en de enzymactiviteit.
Abstract
Receptor-associated enzymen zijn de grote bemiddelaars van cellulaire activering. Deze enzymen zijn geregeld, ten minste gedeeltelijk, fysieke interactie met de cytoplasmatische staarten van de receptoren. De interacties die vaak optreden door middel van specifieke proteïne domeinen en leiden tot activering van de enzymen. Er zijn verschillende methoden om de studie van interacties tussen eiwitten. Hoewel co-immunoprecipitation wordt gebruikt bij het bestuderen van domeinen die vereist voor eiwit-eiwitinteractie zijn, zijn er geen testen dat document de bijdrage van specifieke domeinen naar activiteit van de enzymen van de aangeworven op hetzelfde moment. De hier beschreven methode combineert dienovereenkomstig, co-immunoprecipitation en een enzymatische activiteit op-kraal-assay voor gelijktijdige evaluatie van interacties tussen eiwitten en bijbehorende enzymatische activatie. Het doel van dit protocol is het identificeren van de domeinen die kritisch zijn voor de fysieke interactie tussen een eiwit en enzym en de domeinen die verplicht voor volledige activering van het enzym zijn. Het belang van deze bepaling wordt aangetoond, als bepaalde receptor eiwitten domeinen bijdragen aan de binding van het enzym aan de cytoplasmatische staart van de receptor, terwijl andere domeinen nodig zijn om te regelen van de functie van het zelfde enzym.
Introduction
Katalytische receptoren en receptor tyrosine kinases zijn transmembraan eiwitten waarin binding van een extracellulaire ligand enzymatische activiteit op de intracellulaire kant1 veroorzaakt. Sommige receptoren bezitten zowel de receptor en de enzymatische functies, terwijl anderen specifieke enzymen zoals kinases en phosphatases aan hun cytoplasmatische staarten werven. Aanwerving van een enzym aan de receptor de staart en de daaropvolgende katalytische werking van dit enzym zijn twee afzonderlijke processen die niet altijd door de dezelfde eiwit domeinen2zijn geregeld. Helaas zijn er geen specifieke hulpmiddelen voor het beoordelen van zowel de interactie en de enzymatische activiteit tegelijkertijd. De bepaling van de functionele co-immunoprecipitation hier beschreven is een handige methode om te ontleden de aanwerving van een enzym aan de staart van een receptor van de activering. Deze test maakt gebruik van immunoprecipitation van tagged receptoren door antilichaam beklede kralen. Vervolgens worden een enzymatische activiteit assay zowel de westelijke vlekkenanalyse op parels uitgevoerd. Het algemene doel van deze methode is om te ontdekken welke domeinen eiwitten zijn nodig voor interacties tussen receptoren en enzymen (beoordeeld door westelijke vlekkenanalyse) en welke domeinen zijn verplicht voor volledige activering van de enzymen (gemeten door op-parel enzymatische activiteit assay). Het is belangrijk om instrumenten voor de studie van de afzonderlijke functies van receptor-associated enzymen als gevolg van hun betrokkenheid bij de pathogenese van ziekten bij de mens te ontwikkelen. Bovendien kan verder inzicht in de mechanismen van de actie van deze proteïnen helpen bij het ontwerp van nieuwe therapeutische interventies.
Geprogrammeerde dood-1 (PD-1) is een remmende receptor op het oppervlak van T-cellen en is vereist voor het beperken van excessieve T cel reacties. In de afgelopen jaren zijn anti-PD-1 antilichamen betrokken bij de behandeling van meerdere maligniteiten1,2. PD-1 afbinding weerhoudt talrijke T-cel-functies, met inbegrip van de proliferatie, hechting en secretie van meerdere cytokines3,–4,5. PD-1 is gelokaliseerd aan de immunologische SYNAPS, het raakvlak tussen T-cellen en antigeen-presenteren cellen6, waar het colocalizes met de T-cel-receptor (TCR)7. Vervolgens de tyrosine fosfatase SHP2 [Src homologie 2 (SH2) domein met tyrosine fosfatase 2] is gerekruteerd om de cytoplasmatische staart van PD-1, wat leidt tot dephosphorylation van belangrijke tyrosine residuen binnen de complexe TCR en de bijbehorende proximale signalering moleculen3,4,5,8,9. De cytoplasmatische staart van PD-1 bevat twee tyrosine motieven, een immunoreceptor op basis van tyrosine remmende motief (ITIM) en een immunoreceptor tyrosine gebaseerd-switch motief (ITSM)10. Beide motieven zijn phosphorylated op PD-1 afbinding9,10. Mutagenese studies is gebleken een primaire rol voor de ITSM in SHP2 werving, in tegenstelling tot de ITIM, waarvan de rol in PD-1 signalering en functie niet duidelijk is4.
SHP2 ofwel een gesloten (gevouwen) aanneemt, geremd conformatie of een open (extended), actieve conformatie11. De bijdrage van elk domein van de staart van PD-1 om SHP2 binding of activering is nog niet opgehelderd. Deze vraag te beantwoorden, ontwikkelden we een test waarmee parallelle testen van de aanwerving van SHP2 aan de staart van PD-1 en zijn activiteit12. Wij werkzaam co-immunoprecipitation en een op-kraal fosfatase activiteit assay voor het testen van zowel de interactie en de enzymatische activiteit in parallel. Met behulp van deze bepaling, laten we zien dat de ITSM van PD-1 volstaat om te werven van SHP2 aan de staart voor PD-1, terwijl de ITIM van PD-1 is nodig om volledig uit te breiden en activeren van het enzym.
Er zijn veel receptoren die meerdere aangrenzende domeinen in hun cytoplasmatische staarten hebben. De bepaling van de functionele co-immunoprecipitation kunt ontdekken de rol van specifieke domeinen die nodig voor het eiwit aanwerving of enzymatische activatie zijn.
Protocol
Representative Results
Discussion
Receptor-enzym interacties zijn van cruciaal belang voor het intracellulaire signalering. Vele enzymen worden gerekruteerd voor receptoren via SH2 domeinen binden aan gefosforyleerd tyrosines dat van de staart van de dezelfde receptoren versieren. Echter enzymen zijn vaak gevouwen in gesloten inactief conformaties en activering vereist een conformationele verandering11 die door andere domeinen van de dezelfde receptor gemedieerde kan worden. Hier beschreven de test maatregelen de interacties tusse…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit project werd gefinancierd door de NIH Grants 1R01AI125640-01 en Reumatologie Research Foundation.
Materials
| PBS | Lonza | 17-516F | Phosphate Buffered Saline |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424-R | 1.5 ml |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | Fetal bovine serum |
| Penicillin / Streptomycin | Fisher | BP295950 | |
| DMEM high glucose without L-glutamine | Lonza | BE12-614F | |
| SuperFect Transfection Reagent | Qiagen | 301305 | |
| Anti-SHP2 | Santa Cruz | SC-280 | |
| Anti–GFP-agarose | MBL | D153-8 | |
| Anti-GFP | Roche | 118144600 | |
| Anti-Actin | Santa Cruz | SC-1616 | |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| H2O2 | Sigma | 216763 | 30% |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | EDTA-free |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) | Invitrogen | LC2676 | Modified Laemmli buffer |
| 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Invitrogen | XP04205BOX | 15-well |
| Nitrocellulose membranes | General Electric | 10600004 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Sodium chloride |
| HEPES | Gibco | 15630080 | N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid |
| DTT | Invitrogen | D1532 | Dithiothreitol |
| pNPP | Sigma | 20-106 | p-Nitrophenyl Phosphate |
| NaOH | Sigma | S8045 | Sodium hydroxide |
| BCA | Fisher | 23225 | Bi Cinchoninic Acid assay |
Referências
- Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors. Molecular Cancer. 17 (1), (2018).
- Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S. Selected signalling proteins recruited to the T-cell receptor-CD3 complex. Immunology. 153 (1), 42-50 (2018).
- Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., Pedoeem, A., Mor, A. The coreceptor programmed death 1 inhibits T-cell adhesion by regulating Rap1. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (2), 564-567 (2015).
- Chemnitz, J. M., Parry, R. V., Nichols, K. E., June, C. H., Riley, J. L. SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation. The Journal of Immunology. 173 (2), 945-954 (2004).
- Patsoukis, N., et al. Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation. Science Signaling. 5 (230), 46 (2012).
- Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D. M., Allison, J. P. Programmed death-1 concentration at the immunological synapse is determined by ligand affinity and availability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (45), (2007).
- Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).
- Hui, E., et al. T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition. Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).
- Sheppard, K. A., et al. PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta. FEBS Letters. 574 (1-3), 37-41 (2004).
- Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13866-13871 (2001).
- Sun, J., et al. Antagonism between binding site affinity and conformational dynamics tunes alternative cis-interactions within Shp2. Nature Communications. 4, 2037 (2013).
- Peled, M., et al. Affinity purification mass spectrometry analysis of PD-1 uncovers SAP as a new checkpoint inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E468-E477 (2018).
- Jang, S. H., et al. A protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, inhibits angiotensin II-Induced beta-arrestin cleavage. Molecules and Cells. 28 (1), 25-30 (2009).
- Pluskey, S., Wandless, T. J., Walsh, C. T., Shoelson, S. E. Potent stimulation of SH-PTP2 phosphatase activity by simultaneous occupancy of both SH2 domains. The Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 2897-2900 (1995).
- McAvoy, T., Nairn, A. C. Serine/threonine protein phosphatase assays. Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).
- Shlapatska, L. M., et al. CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A. The Journal of Immunology. 166 (9), 5480-5487 (2001).
