Reseptörleri ve enzimler arasındaki işlevsel etkileşimler çalışmak için Co-immunoprecipitation tahlil
Summary
Burada, co-immunoprecipitation ve plazma membran reseptörleri enzim işe alım ve enzim aktivitesi belirli protein etki katkısını aynı anda çalışmaya bir boncuk üzerinde enzimatik aktivite tahlil için bir iletişim kuralı mevcut.
Abstract
Reseptör ilişkili hücresel harekete geçirmek büyük arabulucu enzimlerdir. Bu enzimler, en azından kısmen, reseptörleri sitoplazmik kuyrukları ile fiziksel etkileşimleri tarafından düzenlenmektedir. Etkileşimleri kez aracılığıyla belirli protein etki oluşur ve enzimler harekete geçirmek içinde neden. Proteinler arasındaki etkileşimler incelemek için birkaç yöntem vardır. Co-immunoprecipitation protein-protein etkileşimleri için gerekli olan etki alanları incelemek için yaygın olarak kullanılır iken, bu belge işe enzimlerin etkinliğini belirli etki alanlarına katkı aynı anda hiçbir deneyleri vardır. Buna göre burada açıklanan yöntemi co-immunoprecipitation ve bir boncuk üzerinde enzimatik aktivite tahlil proteinler ve ilişkili enzimatik harekete geçirmek arasındaki etkileşimler aynı anda değerlendirilmesi için birleştirir. Bu iletişim kuralı bir protein ve enzim ve enzim tam harekete geçirmek için zorunlu olan etki alanları arasında fiziksel etkileşimleri için kritik olan etki alanları tanımlamak için hedeftir. Bu testin önemi gösterdi, diğer etki alanlarındaki aynı enzim fonksiyonu düzenlenmesi için gerekli olmakla birlikte bazı reseptör enzim reseptör, sitoplazmik kuyruk için bağlayıcı protein etki katkıda.
Introduction
Katalitik reseptörleri ve reseptör Tirozin kinaz transmembran proteinler neden olan bir hücre dışı ligand bağlayıcı enzimatik aktivite hücre içi yan1‘ dir. Diğerleri belirli enzimler kinaz ve fosfatazlar sitoplazmik onların kuyrukları için gibi işe iken bazı reseptörleri reseptörü ve enzimatik işlevler, sahip. İşe bir enzim reseptör’ın kuyruğu ve bu enzim sonraki katalitik eylem için her zaman aynı protein etki alanları2tarafından düzenlenir değil iki ayrı işlemler vardır. Ne yazık ki, etkileşim ve enzimatik aktivite aynı anda değerlendirmek için belirli bir aracı vardır. Burada açıklanan fonksiyonel co-immunoprecipitation tahlil bir enzim alımı bir reseptör kuyruğuna onun aktivasyon incelemek için kullanışlı bir yöntemdir. Bu tahlil immunoprecipitation tagged reseptörlerinin antikor kaplı boncuk tarafından kullanır. Daha sonra bir enzim etkinliği tahlil ve western blot Analizi boncuk üzerinde gerçekleştirilir. Hangi protein etki alanlarının reseptörleri ve enzimler (western blot analizi ile değerlendirilmesi) arasındaki etkileşimler için gerekli olduğunu ortaya çıkarmak için bu yöntem genel amacı olduğunu ve hangi etki alanlarının (boncuk üzerinde ölçülen enzimlerin tam harekete geçirmek için zorunlu olduğunu enzimatik aktivite assay). İnsan hastalıkları patogenezinde onların katılımı nedeniyle reseptör ilişkili enzimlerin ayrı işlevleri eğitim araçları geliştirmek önemlidir. Ayrıca, daha fazla bu proteinlerin mekanizmaları anlama roman tedavi müdahaleler tasarım yardımcı olabilir.
Programlanmış ölüm-1 (PD-1) T hücrelerinin yüzeyinde bir inhibitör reseptörü ve aşırı T hücre yanıt-e doğru sınırlamak için gereklidir. Son yıllarda, birden çok maligniteler1,2tedavisinde anti-PD-1 antikorlar karıştığı olmuştur. PD-1 tüp ligasyonu yayılması, yapışma ve salgı birden çok sitokinler3,4,5gibi çok sayıda T hücre işlevi kısıtlayan. PD-1 immünolojik sinaps, T hücreleri ve antijen sunan hücreler6arasında nerede T hücre reseptör (TCR)7ile colocalizes arayüz için yerelleştirilmiştir. Daha sonra Tirozin fosfataz SHP2 [Src Homoloji 2 (SH2) Tirozin fosfataz 2 içeren etki alanını] PD-1 anahtar Tirozin kalıntıları karmaşık TCR ve onun ilişkili içinde proksimal dephosphorylation önde gelen, sitoplazmik kuyruk için oluşturulmuştur sinyal molekülleri3,4,5,8,9. PD-1 sitoplazmik kuyruk iki Tirozin motifleri, bir immunoreceptor Tirozin tabanlı inhibitör motifi (ITIM) ve bir immunoreceptor Tirozin dayalı-anahtar motifi (ITSM)10içerir. Her iki motifleri PD-1 tüp ligasyonu9,10fosforile. Mutagenesis çalışmalar bir birincil rolü için SHP2 işe alım, ITIM rolünü PD-1 sinyal ve fonksiyon açık değildir, aksine4ITSM ortaya çıkardı.
SHP2 ya da kapalı bir (katlanmış) benimser, uyum veya açık bir etkin uyum11(genişletilmiş), inhibe. PD-1 her kuyruk etki alanı SHP2 bağlama ya da harekete geçirmek için katkısını henüz aydınlatılmamıştır değil. Bu soruyu cevaplamak için biz SHP2 istihdamı PD-1 ve onun etkinlik12kuyruk için paralel test sağlar bir tahlil geliştirilmiştir. Co-immunoprecipitation ve etkileşim ve enzimatik aktivite paralel olarak test etmek için bir boncuk üzerinde fosfataz etkinliği tahlil çalıştırmaya başladık. Bu tahlil kullanarak, PD-1 ITSM ITIM PD-1 tam olarak genişletmek ve enzim harekete geçirmek için gerekli süre SHP2 PD-1, kuyruk için işe almak için yeterli olduğunu göstereceğiz.
Çeşitli bitişik etki alanlarına sitoplazmik onların kuyrukları birçok reseptörleri vardır. Fonksiyonel co-immunoprecipitation tahlil protein alımı ya da enzimatik harekete geçirmek için gerekli olan belirli etki alanları rolünü ortaya çıkarmak.
Protocol
Representative Results
Discussion
Reseptör-enzim etkileşimleri hücre içi sinyal için büyük önem taşımaktadır. Birçok enzim reseptörleri SH2 etki alanları aynı reseptörlerinin kuyrukları süslemeleri fosforile tyrosines bağlama aracılığıyla işe. Ancak, enzimler kez kapalı etkin olmayan biçimler katlanmış ve diğer etki alanlarının aynı reseptör aracılı konformasyonal değişim11 istemek harekete geçirmek. Tahlil reseptörleri ve enzimler gibi faaliyet arasındaki etkileşimler bu etkileşimler tara…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu proje NIH hibe 1R01AI125640-01 ve Romatoloji Araştırma Vakfı tarafından finanse edildi.
Materials
| PBS | Lonza | 17-516F | Phosphate Buffered Saline |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424-R | 1.5 ml |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | Fetal bovine serum |
| Penicillin / Streptomycin | Fisher | BP295950 | |
| DMEM high glucose without L-glutamine | Lonza | BE12-614F | |
| SuperFect Transfection Reagent | Qiagen | 301305 | |
| Anti-SHP2 | Santa Cruz | SC-280 | |
| Anti–GFP-agarose | MBL | D153-8 | |
| Anti-GFP | Roche | 118144600 | |
| Anti-Actin | Santa Cruz | SC-1616 | |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| H2O2 | Sigma | 216763 | 30% |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | EDTA-free |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) | Invitrogen | LC2676 | Modified Laemmli buffer |
| 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Invitrogen | XP04205BOX | 15-well |
| Nitrocellulose membranes | General Electric | 10600004 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Sodium chloride |
| HEPES | Gibco | 15630080 | N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid |
| DTT | Invitrogen | D1532 | Dithiothreitol |
| pNPP | Sigma | 20-106 | p-Nitrophenyl Phosphate |
| NaOH | Sigma | S8045 | Sodium hydroxide |
| BCA | Fisher | 23225 | Bi Cinchoninic Acid assay |
Referências
- Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors. Molecular Cancer. 17 (1), (2018).
- Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S. Selected signalling proteins recruited to the T-cell receptor-CD3 complex. Immunology. 153 (1), 42-50 (2018).
- Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., Pedoeem, A., Mor, A. The coreceptor programmed death 1 inhibits T-cell adhesion by regulating Rap1. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (2), 564-567 (2015).
- Chemnitz, J. M., Parry, R. V., Nichols, K. E., June, C. H., Riley, J. L. SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation. The Journal of Immunology. 173 (2), 945-954 (2004).
- Patsoukis, N., et al. Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation. Science Signaling. 5 (230), 46 (2012).
- Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D. M., Allison, J. P. Programmed death-1 concentration at the immunological synapse is determined by ligand affinity and availability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (45), (2007).
- Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).
- Hui, E., et al. T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition. Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).
- Sheppard, K. A., et al. PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta. FEBS Letters. 574 (1-3), 37-41 (2004).
- Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13866-13871 (2001).
- Sun, J., et al. Antagonism between binding site affinity and conformational dynamics tunes alternative cis-interactions within Shp2. Nature Communications. 4, 2037 (2013).
- Peled, M., et al. Affinity purification mass spectrometry analysis of PD-1 uncovers SAP as a new checkpoint inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E468-E477 (2018).
- Jang, S. H., et al. A protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, inhibits angiotensin II-Induced beta-arrestin cleavage. Molecules and Cells. 28 (1), 25-30 (2009).
- Pluskey, S., Wandless, T. J., Walsh, C. T., Shoelson, S. E. Potent stimulation of SH-PTP2 phosphatase activity by simultaneous occupancy of both SH2 domains. The Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 2897-2900 (1995).
- McAvoy, T., Nairn, A. C. Serine/threonine protein phosphatase assays. Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).
- Shlapatska, L. M., et al. CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A. The Journal of Immunology. 166 (9), 5480-5487 (2001).
