Reverse transkription-Loop-medieret isotermisk forstærkning (RT-lampe) Assay for Zika Virus og husholdning gener i urin, Serum og myg prøver
Summary
Denne protokol giver en effektiv og billig metode til at registrere Zika virus eller styre mål i human urin og serum prøver eller myg ved reverse transkription loop-medieret isotermisk forstærkning (RT-lampe). Denne metode kræver ikke RNA isolering og kan ske inden for 30 min.
Abstract
Infektion med Zika virus (ZIKV) kan være asymptomatisk hos voksne, men infektion under graviditet kan føre til abort og alvorlige neurologiske fødselsdefekter. Målet med denne protokol er at hurtigt opdage ZIKV i både menneskelige og myg prøver. Den nuværende guld standard for ZIKV påvisning er kvantitative reverse transkription PCR (qRT-PCR); reverse transkription loop-medieret isotermisk forstærkning (RT-lampe) kan give mulighed for en mere effektiv og billig test uden behov for dyrt udstyr. I denne undersøgelse bruges RT-LAMPEN til påvisning af ZIKV i forskellige biologiske prøver inden for 30 min, uden første isolering af RNA fra prøven. Denne teknik er påvist ved hjælp af ZIKV inficerede patient urin og serum, og inficerede myg prøver. 18s ribosomale ribonukleinsyre og actin er brugt som kontrolelementer i menneskelige og myg prøver, henholdsvis.
Introduction
I 2015 fik Zika virus (ZIKV) fremtrædende global opmærksomhed som en smitsom sygdom giver anledning til bekymring for infektion under graviditet var forbundet med abort, dødfødsel, alvorlige neurologiske fødselsdefekter herunder mikrocefali, såvel som andre medfødte fødselsdefekter1. I sjældne tilfælde, har ZIKV været forbundet med Guillain-Barre syndrom. ZIKV er primært overføres af Aedes myg; Det kan dog også spredes gennem seksuel kontakt1. Betragtning af, at infektion med ZIKV er asymptomatisk hos de fleste mennesker eller præsenterer med milde influenza-lignende symptomer som overlapper med symptomer på infektion af andre arborviruses1, var der behov for forbedrede metoder til hurtig og omkostningseffektiv påvisning af ZIKV til skærmen såvel mennesker som lokale mosquito befolkninger.
Kvantitative reverse transkription PCR (qRT-PCR) er en pålidelig analyse til registrering af ZIKV; denne teknik kræver dog dyrt specialudstyr, uddannet personale og RNA isolering fra prøven af interesse. Reverse transkription loop-medieret isotermisk forstærkning (RT-lampe) er en et-trins nukleinsyre amplifikation metode baseret på PCR-teknologi, der kun kræver én inkubation temperatur på grund af brugen af en termofile DNA polymerase med strand forskydning egenskaber. Det omgår behovet for en thermocycler og nedsætter længden af tid, det tager at fuldføre analysen. Yderligere fordele ved RT-lampe omfatter høj specificitet og følsomhed, robusthed på en række pH-niveauer og temperaturer og modstand mod mange PCR-hæmmere2. Det har en relativt lav pris og reagenser er stabile ved stuetemperatur. I betragtning af disse karakteristika, kan RT-lampe være indsat i et laboratorium eller i feltet. Som sådan, har lampe reaktioner udviklet til at opdage en række patogener og andre former for infektion3,4,5. Målet med RT-lampe protokollen beskrevet i denne hvidbog er at opdage ZIKV uden RNA isolering i human serum og urin prøver så godt som en enkelt inficerede myg indenfor 30 min via RT-lampe. Denne metode kan bruges til at erstatte qRT-PCR, da det er en følsom, hurtig diagnostisk værktøj, der fungerer hurtigt og i indstillinger uden for laboratoriet.
Protocol
Representative Results
Discussion
ZIKV RT-lampe analysen beskrives i dette papir værker ved hjælp af både menneskelige og myg prøver6. Detektionsgrænsen var ca 1 genom tilsvarende6, som bør være tilstrækkeligt, da den typiske viral belastning af en symptomatisk ZIKV inficeret patient er 103 til 106 PFU/mL7. Derudover kan denne metode registrerer ZIKV i prøver uden første isolere RNA og uden virus forstærkning i cellekultur. Dette mindsker …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Maureen og Ronald Hirsch familie filantropiske bidrag og felt neurovidenskab Institute, St. Marys i Michigan. Finansieringskilderne spillede ingen rolle i undersøgelse design, dataindsamling og analyse, beslutningen om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet. Vi takker også Dr. Bernadette Zwaans og Elijah Ward for deres kritiske gennemgang af håndskriftet.
Materials
| Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase | New England Biolabs | M0537S | |
| Isothermal Amplification Buffer | New England Biolabs | B0537S | |
| WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380S | |
| Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372S | |
| MgSO4 | New England Biolabs | B1003S | |
| 100mM dATP Solution | New England Biolabs | N0440S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dCTP Solution | New England Biolabs | N0441S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dTTP Solution | New England Biolabs | N0443S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dGTP Solution | New England Biolabs | N0442S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100mM dUTP Solution | Thermo Fisher Scientific | R0133 | |
| SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S7563 | |
| Nancy-520 | Sigma Aldrich | 01494 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10-068-013 | |
| Zika Postive Control | Robert Koch Institute, Germany | N/A | |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | BP1600 | |
| BlueJuice Gel Loading Buffer | Invitrogen | 10816015 | |
| Primers | Integrated DNA Technologies | Custom Oligo | |
| Nuclease-Free Water | Ambion | AM9938 | |
| Urine Preservative | Norgen Biotek | 18126 | |
| ZIKV PCR Standard | Robert Koch Institute | N/A | Vero E6 cell supernatants |
| DENV2 New Guinea C Control | Connecticut Agricultural Experiment Station | N/A |
Referências
- Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. New England Journal of Medicine. 374 (16), 1552-1563 (2016).
- Francois, P., et al. Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications. Federation of European Microbiological Societies Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nature Protocols. 3 (5), 877-882 (2008).
- Gandasegui, J., et al. The Rapid-Heat LAMPellet Method: A Potential Diagnostic Method for Human Urogenital Schistosomiasis. Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 9 (7), 0003963 (2015).
- Barkway, C. P., Pocock, R. L., Vrba, V., Blake, D. P. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the species-specific detection of Eimeria that infect chickens. The Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Lamb, L. E., et al. Rapid Detection of Zika Virus in Urine Samples and Infected Mosquitos by Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification. Scientific Reports. 8 (1), 3803 (2018).
- Faye, O., et al. One-step RT-PCR for detection of Zika virus. Journal of Clinical Virology. 43 (1), 96-101 (2008).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors – occurrence, properties and removal. Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).
- Poole, C. B., Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C., Carlow, C. K. Diagnosis of brugian filariasis by loop-mediated isothermal amplification. Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 6 (12), 1948 (2012).
- Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C. Simultaneous multiple target detection in real-time loop-mediated isothermal amplification. Biotechniques. 53 (2), 81-89 (2012).
- Chan, K., et al. Rapid, Affordable and Portable Medium-Throughput Molecular Device for Zika Virus. Scientific Reports. 6, 38223 (2016).
- Lee, D., et al. Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays. Analytical Chemistry. 88 (24), 12272-12278 (2016).
- Pardee, K., et al. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Song, J., et al. Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus. Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).
- Yaren, O., et al. Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya. BioMed Central Infectious Diseases. 17 (1), 293 (2017).
- Wang, X., et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).
- Priye, A., et al. A smartphone-based diagnostic platform for rapid detection of Zika, chikungunya, and dengue viruses. Scientific Reports. 7, 44778 (2017).
