Reverter a transcrição Loop-mediada por amplificação isotérmica (RT-lâmpada) ensaio para vírus Zika e Housekeeping Genes em amostras de Mosquito, soro e urina

Resumo

Este protocolo fornece um método eficiente e de baixo custo para detectar vírus Zika ou controlar alvos em amostras de urina e soro humanas ou em mosquitos por amplificação isotérmica transcrição reversa mediada por laço (RT-lâmpada). Este método não requer isolamento de RNA e pode ser feito dentro de 30 min.

Resumo

Infecção com vírus Zika (ZIKV) pode ser assintomática em adultos, no entanto, a infecção durante a gravidez pode levar a aborto e neurológicos graves defeitos de nascimento. O objetivo do presente protocolo é rapidamente detectar ZIKV em amostras de ambos humanos e mosquito. O atual padrão-ouro para a deteção de ZIKV é quantitativa transcrição reversa PCR (qRT-PCR); amplificação isotérmica transcrição reversa mediada por laço (RT-lâmpada) pode permitir um teste mais eficiente e de baixo custo sem a necessidade de equipamento caro. Neste estudo, RT-lâmpada é utilizada para detecção de ZIKV em diversas amostras biológicas dentro de 30 min, sem primeiro a isolar o RNA da amostra. Esta técnica é demonstrada usando ZIKV infectados, soro e urina de paciente e infectado amostras de mosquito. O ácido ribonucleico ribossomal 18s e actina são usados como controles em amostras de humanos e mosquito, respectivamente.

Introdução

Em 2015, vírus Zika (ZIKV) ganharam atenção mundial proeminente como uma doença infecciosa de preocupação porque infecção durante a gravidez estava ligada ao aborto, morte fetal, graves defeitos congênitos neurológicos incluindo microcefalia, bem como outras doenças congênitas defeitos de nascimento¹. Em casos raros, ZIKV tem sido associado com a síndrome de Guillain-Barré. ZIKV é transmitida principalmente pelo Aedes mosquitos; no entanto, ele também pode ser transmitido através de de contato sexual¹. Dado que a infecção com ZIKV é assintomática na maioria das pessoas ou apresenta com gripe-como sintomas leves ....

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados por institucional Review Board (IRB) de saúde de Beaumont. Todos os experimentos foram realizados em conformidade com os regulamentos e orientações pertinentes.

Atenção: Todos os materiais potencialmente infecciosos devem ser manuseados de acordo com as normas de biossegurança nível 2, incluindo o uso de equipamentos de proteção individual. Quaisquer procedimentos que podem produzir aerossol devem ser executados em uma armário de biossegurança. Além disso, trabalho com mosquitos ao vivo deve ser realizado nas instalações adequadas artrópode contenção nível 1-3. Dada a associação da infecção ZI....

Resultados

Reações de RT-lâmpada podem ser analisadas usando três métodos diferentes. Primeiro, com a adição de um corante fluorescente de ácidos nucleicos, reações positivas será na cor verde/amarelo onde reações negativas aparecerão laranja na cor a olho nu. Em segundo lugar, a adição do corante para reação de RT-lâmpada fluorescente de ácidos nucleicos resulta em um sinal fluorescente quando as amostras são excitadas pela luz UV. Reações negativas não terá um sinal fluorescente detectável sobre q.......

Discussão

O ensaio de ZIKV RT-lâmpada descrito neste papel de trabalhos usando tanto humanos como mosquito amostras⁶. O limite de detecção foi de aproximadamente 1 genoma equivalente⁶, que devem ser suficientes, desde que a carga viral típica de um paciente ZIKV infectado sintomático é 10³ a 10⁶ PFU/mL⁷. Além disso, este método pode detectar ZIKV em amostras sem primeiro isolamento de RNA e sem amplificação do vírus em cultura .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Bst 2.0 WarmStart DNA polimerase	New England Biolabs	M0537S
	New England Biolabs	B0537S
WarmStart RTx Transcriptase reversa	New England Biolabs	M0380S
Termolábil antártico UDG	New England Biolabs	M0372S
MgSO4	England Biolabs	B1003S
100 mM dATP Solução	New England Biolabs	N0440S	Conjunto de desoxinucleotídeos N0446S
Solução de 100 mM dCTP	New England Biolabs	N0441S	Conjunto de desoxinucleotídeos N0446S
100 mM dTTP Solução	New England Biolabs	N0443S	Conjunto de desoxinucleotídeos N0446S
100 mM dGTP Solução	New England Biolabs	N0442S	Conjunto de desoxinucleotídeos N0446S
100 mM dUTP Solução	Thermo Fisher Scientific	R0133
SYBR Green I Ácido nucleico Mancha de gel	Invitrogen	S7563
Nancy-520	Sigma Aldrich	01494
Escada de baixa massa de DNA	Invitrogen	10-068-013
Controle positivo de Zika	Robert Koch Institute, Alemanha	N / A
Agarose	Thermo Fisher Scientific	BP1600
BlueJuice Gel Buffer de carregamento	Invitrogen
Primers	Integrated DNA Technologies	Água Livre
	Personalizada Ambion	AM9938
Conservante de Urina	Norgen Biotek	18126
Padrão de PCR ZIKV	Instituto Robert Koch N	/ A	Sobrenadantes de células Vero E6
DENV2 Nova Guiné C Controle	Experimento Agrícola de Connecticut Estação	N/A

Tampão de Amplificação Isotérmica New 10816015 de Oligonuclease