Myeloische angeborene Signalisierung Pathway Verordnung von MALT1 Paracaspase Tätigkeit
Summary
MALT1 regelt die angeborene Immunität, aber wie in diesem Fall bleibt unklar. Wir verwendet die selektive MALT1 Paracaspase Inhibitor MLT-827 um zu entwirren den Beitrag von MALT1 zur angeborenen Signalisierung von Toll-Like oder C-Art Lectin-Like-Rezeptoren, zeigen, dass MALT1 die Produktion der myeloischen Zytokine reguliert, vor- und nachgelagerten der C-Art Lectin-Like-Rezeptoren selektiv.
Abstract
Neben seiner Funktion in lymphoiden Zellen, die durch zahlreiche Studien behandelt wurden, Rolle die Paracaspase MALT1 auch eine wichtige in angeborene Zellen unterhalb der Muster-Erkennung-Rezeptoren. Am besten untersucht sind die Dectin-1 und Dectin-2 Mitglieder der C-Typ-Lektin-Like-Rezeptor-Familie, die eine SYK – und CARD9-abhängige Signalkaskade zu NF-κB Aktivierung in einem MALT1-abhängigen Weise zu induzieren. Propagieren Sie durch Kontrast, Toll-Like-Rezeptoren (TLR), z. B. TLR-4 NF-κB Aktivierung aber Signal über eine Kaskade von MYD88/IRAK-abhängige. Dennoch, ob MALT1 TLR-4 Signalisierung beitragen kann ist unklar geblieben. Den letzten deutet mit MLT-827, ein potenter und selektiver Inhibitor von MALT1 Paracaspase Aktivität, darauf hin, dass TNF-Produktion flussabwärts von TLR-4 in menschlichen myeloische Zellen unabhängig von MALT1, im Gegensatz zu TNF-Produktion flussabwärts von Dectin-1, das ist MALT1 angewiesen. Hier haben wir die selektive Einbeziehung von MALT1 in Mustererkennung Fernerkundung weiter, unter Verwendung einer Vielzahl von Mensch und Maus zellulären Präparate und Stimulation der Dectin-1, MINCLE oder TLR-4 Bahnen. Wir lieferten auch zusätzliche Erkenntnisse durch die Zytokine TNF-Erforschung und durch den Vergleich von MLT-827 ein SYK-Inhibitor (Cpd11) und ein IKK-Inhibitor (AFN700). Gemeinsam zur Verfügung gestellten Daten weitere Beweise für die MALT1-Abhängigkeit der C-Art Lectin-Like Rezeptor-Signalisierung im Gegensatz zu TLR-Signalisierung.
Introduction
Die Paracaspase Aktivität von MALT1 (Mucosa-assoziierte Lymphgewebe Lymphom Translokation Protein 1) zeigte sich in 20081,2. Seit dieser Zeit haben eine Reihe von Studien ihren kritischen Beitrag zur Antigen-Rezeptor-Antworten in Lymphozyten berichtet. Genetische Modelle in der Maus sowie Pharmakologie Daten eine wichtige Rolle in T-Zellen, T-Zell-abhängigen Autoimmunität und B-Zell-Lymphom Einstellungen3,4unterstützen. In Lymphozyten, MALT1 Paracaspase Ansteuerung erfolgt bei der Montage eines CARD11-BCL10-MALT1 Komplex5, ausgelöst durch Antigen-Rezeptor proximalen signalisieren stromabwärts des T – oder B-Zell-Rezeptors. Es gibt auch genügend Beweise, dass ein ähnlicher CARD9-BCL10-MALT1-Komplex wichtig ist für die Vermehrung Signale unterhalb der C-Art Lectin-Like-Rezeptoren (CLLR), z. B., Dectin-1, Dectin-2 und MINCLE in myeloische Zellen6,7. Dectin-1 ist besonders gut untersucht worden, weil dieser Weg für Host Verteidigung gegen Pilzinfektionen8,9entscheidend. Auswirkung von MALT1 in Toll-Like-Rezeptor (TLR) Wege, ist jedoch umstritten10geblieben. Den letzten Beweis in menschlichen myeloische Zellen ausgeschlossen, eine direkte Rolle für MALT1 Paracaspase Aktivität in die Regulierung der TNF-Produktion flussabwärts von TLR-4-11.
In der vorliegenden Arbeit verwendeten wir verschiedene experimentelle Einstellungen und stimulierende Bedingungen in Mensch und Maus myeloische Zellen um angeborene Signalwege Sonde unter Berufung auf spezifische pharmakologische Werkzeug-Inhibitoren und Messung der Produktion von Zytokinen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Arbeit verwendeten wir einfache experimentelle Einstellungen um Signalwege in der Human- und angeborene Mauszellen zu studieren und ihre Abhängigkeit von MALT1 proteolytischen Funktion zu verhören. Aufbauend auf früheren Arbeiten11, zeigte unsere Studie, dass MALT1 Paracaspase Aktivität C-Type Lektin-ähnlichen Rezeptoren induzierte Produktion von Zytokinen, einschließlich TNF-α steuert. Im Gegensatz dazu war TLR-4-induzierte TNF-α unabhängig von MALT1 in beiden Arten. Kollektiv,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken für ihre Berechtigung (Lizenz-Nummer 4334770630127), hier zu reproduzieren Figur 2A von Unterreiner Et Al. Elsevier (2017).
Materials
| 100 µm nylon cell strainer | Sigma | CLS431752 | |
| 14 ml Falcon tube | BD Falcon | 352057 | |
| 15 mL Falcon tube | Falcon | 352090 | |
| 50 mL Falcon tube | Falcon | 352070 | |
| 6 well plates | Costar | 3516 | |
| 96 well flat-bottom plate, with low evaporation lid | Costar | 3595 | |
| 96 well V-bottom plate | Costar | 734-1798 | |
| Ammonium Chloride – NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Assay diluent RD1-W ELISA | R&D | 895038 | Assay diluent |
| Cell culture microplate, 384 well, black | Greiner | 781986 | |
| Depleted Zymosan | Invivogen | tlrl-dzn | now: tlrl-zyd |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | DMSO |
| EDTA-Na2 | Sigma | E5134 | Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate |
| ELISA muTNF-α | R&D | SMTA00 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| gentleMACS C tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| GM-CSF | Novartis | – | |
| Heat-inactivated Fetal bovine serum | Gibco | 10082 | FBS |
| HTRF hu IL-23 | CisBio | 62HIL23PEG | |
| HTRF hu TNF-α | CisBio | 62TNFPEC | |
| HTRF reconstitution buffer | CisBio | 62RB3RDE | 50mM Phosphate buffer, pH 7.0, 0.8M KF, 0.2% BSA |
| IFN-γ | R&D | L4516 | |
| IL-4 | Novartis | – | |
| Isoflurane | Abbott | Forene | |
| Lipopolysaccharides (LPS) | Sigma | L4391 | LPS used in human samples |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L4516 | LPS used in murine samples |
| Lysis buffer | Self-made | – | 155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 1 mM EDTA, pH 7.4 |
| Magnet | Stemcell | 18001 | |
| Microplate, 384 well white | Greiner | 784075 | |
| Monocytes enrichment kit | Stemcell | 19059 | |
| Nalgene Mr. Frosty Cryo 1 °C Freezing Container | Nalgene | 5100-0001 | cooling device (containing Propanol-2) |
| PBS 1x pH 7.4 [-] CaCl2 [-] MgCl2 | Gibco | 10010 | Phosphate-buffered saline |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | Pen/Strep |
| Potassium bicarbonate – KHCO3 | Sigma | P9144 | |
| PrestoBlue | Invitrogen | A13262 | Resazurin solution for viability assessment |
| Propanol-2 | Merck | 1.09634 | |
| Read buffer | MesoScale Discovery | R92TC-3 | Tris-based buffer containing tripropylamine |
| Recovery cell culture freezing medium | Gibco | 12648-010 | freezing medium |
| Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) with Glutamax | Gibco | 61870 | + 10% FBS for iMoDCs + 10% FBS + 1 mM Sodium Pyruvate + 100 U/mL Pen/Strep + 5 µM β-mercaptoethanol for human PBMCs and monocytes + 10% FBS + Pen/Strep + 5 µM β-mercaptoethanol for murine splenocytes |
| Separation buffer | Self-made | – | PBS pH 7.4 + 2% FBS + 1 mM EDTA pH 8.0 |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| Trehalose-6,6-dibehenate | Invivogen | tlrl-tdb | TDB |
| Tween 20 | Sigma | P7949 | Polysorbate 20 |
| UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | 15675 | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Viewseal sealer | Greiner BioOne | 676070 | |
| V-PLEX Proinflammatory Panel 1 Human Kit | MesoScale Discovery | K15049D | electrochemiluminescent multiplex assay (IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8) |
| β-Mercaptoethanol | Gibco | 31350 |
Referências
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