Myeloid medfødte signalnettverk Pathway regulering av MALT1 Paracaspase aktivitet
Summary
MALT1 regulerer medfødt immunitet men hvordan dette skjer fortsatt dårlig definerte. Vi brukte den selektive MALT1 paracaspase inhibitor MLT-827 for å rakne bidraget fra MALT1 til medfødte signalering nedstrøms Toll-like eller C-type Lektiner-like reseptorer, viser at MALT1 regulerer produksjonen av myelogen cytokiner, og nedstrøms av C-type Lektiner-like reseptorer, selektivt.
Abstract
Foruten dens funksjon i lymfoide celler, som er rettet av en rekke studier, spiller paracaspase MALT1 også en viktig rolle i medfødte cellene nedstrøms i mønster anerkjennelse reseptorer. Best studerte er Dectin-1 og Dectin-2 medlemmer av C-type Lektiner-like reseptor familien som induserer en SYK – og CARD9-avhengige signalering gjennomgripende fører til NF-κB aktivisering, på en måte som MALT1-avhengige. I motsetning Toll-like reseptorer (TLR), for eksempel TLR-4, overføre NF-κB aktivisering men signalet via en MYD88/IRAK-avhengige cascade. Likevel har om MALT1 kan bidra til TLR-4 signalering forblitt uklart. Nyere bevis med MLT-827, en potent og selektiv hemmer MALT1 paracaspase aktivitet, angir at TNF-produksjon nedstrøms av TLR-4 i menneskelige myeloide celler er uavhengig av MALT1, i motsetning til TNF-produksjon nedstrøms av Dectin-1, som er MALT1 avhengige. Her behandlet vi selektiv involvering av MALT1 i mønstergjenkjenning sensing videre, ved hjelp av en rekke menneskelige og mus mobilnettet forberedelser og stimulering av Dectin-1, MINCLE eller TLR-4. Vi har også gitt ytterligere innsikt ved å utforske cytokiner TNF- og sammenligne MLT-827 en SYK hemmer (Cpd11) og en IKK inhibitor (AFN700). Kollektivt, oppgitt ytterligere bevis for MALT1-avhengigheten av C-type Lektiner-like reseptor-signalisering derimot til TLR-signalisering.
Introduction
Paracaspase aktiviteten til MALT1 (Mucosa-assosiert lymfoid vev lymfom translokasjon protein 1) ble avslørt i 20081,2. Siden da har en rekke studier rapportert sitt viktige bidrag til antigen reseptor svar i lymfocytter. Genetisk modeller i musen samt farmakologi dataene støtter en nøkkelrolle i T-celler, T-celle avhengige autoimmunitet og B-celle lymfom innstillinger3,4. Lymfocytter, MALT1 paracaspase aktivisering oppstår ved montering av CARD11-BCL10-MALT1 komplekse5, som utløses av antigen-reseptor proksimale signalering nedstrøms T – eller B-celle reseptor. Det er også rikelig bevis for at en lignende CARD9-BCL10-MALT1-komplekset er viktig for å spre signaler nedstrøms av C-type Lektiner-like reseptorer (CLLR), f.eks, Dectin-1, Dectin-2 og MINCLE i myeloide celler6,7. Dectin-1 har vært spesielt godt studert fordi denne veien er avgjørende for vert forsvar mot soppinfeksjoner8,9. Implikasjonen av MALT1 i Toll-like reseptor (TLR) veier, men har vært kontroversielle10. Nyere bevis i menneskelige myeloide celler beherske ut en direkte rolle for MALT1 paracaspase aktivitet i regulering av TNF-produksjon nedstrøms TLR-4-11.
I den nåværende arbeidet brukt vi ulike eksperimentelle innstillinger og stimulerende forhold i menneskelig og mus myeloide celler for å undersøke medfødte signalveier, avhengig av spesifikke farmakologiske verktøyet hemmere og måling av cytokiner produksjonen.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette arbeidet brukte vi enkle eksperimentelle innstillinger å studere signalveier i menneskelig og mus medfødte celler, og avhøre avhengigheten MALT1 proteolytisk funksjonen. Utvide på tidligere arbeid11, viste vår studie at MALT1 paracaspase aktivitet styrer C-type Lektiner-like reseptor indusert cytokin produksjon, inkludert TNF-α. Derimot var TLR-4-indusert TNF-α uavhengig av MALT1 i begge arter. Samlet bekreftet disse data nøkkel og selektivt bidrag av MALT1/CBM signalosome nedstrø…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Elsevier om deres tillatelse (med lisens antallet 4334770630127) til å gjengi her figur 2A fra Unterreiner et al. (2017).
Materials
| 100 µm nylon cell strainer | Sigma | CLS431752 | |
| 14 ml Falcon tube | BD Falcon | 352057 | |
| 15 mL Falcon tube | Falcon | 352090 | |
| 50 mL Falcon tube | Falcon | 352070 | |
| 6 well plates | Costar | 3516 | |
| 96 well flat-bottom plate, with low evaporation lid | Costar | 3595 | |
| 96 well V-bottom plate | Costar | 734-1798 | |
| Ammonium Chloride – NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Assay diluent RD1-W ELISA | R&D | 895038 | Assay diluent |
| Cell culture microplate, 384 well, black | Greiner | 781986 | |
| Depleted Zymosan | Invivogen | tlrl-dzn | now: tlrl-zyd |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | DMSO |
| EDTA-Na2 | Sigma | E5134 | Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate |
| ELISA muTNF-α | R&D | SMTA00 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| gentleMACS C tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| GM-CSF | Novartis | – | |
| Heat-inactivated Fetal bovine serum | Gibco | 10082 | FBS |
| HTRF hu IL-23 | CisBio | 62HIL23PEG | |
| HTRF hu TNF-α | CisBio | 62TNFPEC | |
| HTRF reconstitution buffer | CisBio | 62RB3RDE | 50mM Phosphate buffer, pH 7.0, 0.8M KF, 0.2% BSA |
| IFN-γ | R&D | L4516 | |
| IL-4 | Novartis | – | |
| Isoflurane | Abbott | Forene | |
| Lipopolysaccharides (LPS) | Sigma | L4391 | LPS used in human samples |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L4516 | LPS used in murine samples |
| Lysis buffer | Self-made | – | 155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 1 mM EDTA, pH 7.4 |
| Magnet | Stemcell | 18001 | |
| Microplate, 384 well white | Greiner | 784075 | |
| Monocytes enrichment kit | Stemcell | 19059 | |
| Nalgene Mr. Frosty Cryo 1 °C Freezing Container | Nalgene | 5100-0001 | cooling device (containing Propanol-2) |
| PBS 1x pH 7.4 [-] CaCl2 [-] MgCl2 | Gibco | 10010 | Phosphate-buffered saline |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | Pen/Strep |
| Potassium bicarbonate – KHCO3 | Sigma | P9144 | |
| PrestoBlue | Invitrogen | A13262 | Resazurin solution for viability assessment |
| Propanol-2 | Merck | 1.09634 | |
| Read buffer | MesoScale Discovery | R92TC-3 | Tris-based buffer containing tripropylamine |
| Recovery cell culture freezing medium | Gibco | 12648-010 | freezing medium |
| Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) with Glutamax | Gibco | 61870 | + 10% FBS for iMoDCs + 10% FBS + 1 mM Sodium Pyruvate + 100 U/mL Pen/Strep + 5 µM β-mercaptoethanol for human PBMCs and monocytes + 10% FBS + Pen/Strep + 5 µM β-mercaptoethanol for murine splenocytes |
| Separation buffer | Self-made | – | PBS pH 7.4 + 2% FBS + 1 mM EDTA pH 8.0 |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| Trehalose-6,6-dibehenate | Invivogen | tlrl-tdb | TDB |
| Tween 20 | Sigma | P7949 | Polysorbate 20 |
| UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | 15675 | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Viewseal sealer | Greiner BioOne | 676070 | |
| V-PLEX Proinflammatory Panel 1 Human Kit | MesoScale Discovery | K15049D | electrochemiluminescent multiplex assay (IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8) |
| β-Mercaptoethanol | Gibco | 31350 |
Referências
- Coornaert, B., et al. T cell antigen receptor stimulation induces MALT1 paracaspase-mediated cleavage of the NF-kappaB inhibitor A20. Nature immunology. 9 (3), 263-271 (2008).
- Rebeaud, F., et al. The proteolytic activity of the paracaspase MALT1 is key in T cell activation. Nature immunology. 9 (3), 272-281 (2008).
- Jaworski, M., Thome, M. The paracaspase MALT1: Biological function and potential for therapeutic inhibition. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (3), 459-473 (2016).
- Meininger, I., Krappmann, D. Lymphocyte signaling and activation by the CARMA1-BCL10-MALT1 signalosome. Biological Chemistry. 397 (12), 1315-1333 (2016).
- Qiao, Q., et al. Structural architecture of the CARMA1/Bcl10/MALT1 signalosome: nucleation-induced filamentous assembly. Molecular cell. 51 (6), 766-779 (2013).
- Gross, O., et al. Card9 controls a non-TLR signalling pathway for innate anti-fungal immunity. Nature. 442 (7103), 651-656 (2006).
- Chiffoleau, E. C-type lectin-like receptors as emerging orchestrators of sterile inflammation represent potential therapeutic targets. Frontiers in Immunology. 9 (FEB), 1-9 (2018).
- Taylor, P. R., et al. Dectin-1 is required for beta-glucan recognition and control of fungal infection. Nature Immunology. 8 (1), 31-38 (2007).
- Lanternier, F., et al. Primary immunodeficiencies underlying fungal infections. Current opinion in pediatrics. 25 (6), 736-747 (2013).
- Thome, M. Multifunctional roles for MALT1 in T-cell activation. Nature reviews. Immunology. 8 (7), 495-500 (2008).
- Unterreiner, A., Stoehr, N., Huppertz, C., Calzascia, T., Farady, C. J., Bornancin, F. Selective MALT1 paracaspase inhibition does not block TNF-α production downstream of TLR-4 in myeloid cells. Immunology Letters. , 48-51 (2017).
- Strasser, D., et al. Syk Kinase-Coupled C-type Lectin Receptors Engage Protein Kinase C-δ to Elicit Card9 Adaptor-Mediated Innate Immunity. Immunity. 36 (1), 32-42 (2012).
- Jaworski, M., et al. Malt1 protease inactivation efficiently dampens immune responses but causes spontaneous autoimmunity. The EMBO journal. 33 (23), 2765-2781 (2014).
- Yu, J. W., et al. MALT1 protease activity is required for innate and adaptive immune responses. PLoS ONE. 10 (5), 1-20 (2015).
- Bardet, M., et al. The T-cell fingerprint of MALT1 paracaspase revealed by selective inhibition. Immunology and Cell Biology. 96 (1), 81-99 (2018).
- Thoma, G., et al. Discovery and profiling of a selective and efficacious syk inhibitor. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (4), 1950-1963 (2015).
- Bauer, B., Steinle, A. HemITAM: A single tyrosine motif that packs a punch. Science Signaling. 10 (508), 1-10 (2017).
- Gringhuis, S. I., et al. Selective c-Rel activation via Malt1 controls anti-fungal TH-17 immunity by dectin-1 and dectin-2. PLoS Pathogens. 7 (1), (2011).
- Dufner, A., Schamel, W. W. B cell antigen receptor-induced activation of an IRAK4-dependent signaling pathway revealed by a MALT1-IRAK4 double knockout mouse model. Cell Communication and Signaling. 9 (1), 6 (2011).
- Phelan, J. D., et al. A multiprotein supercomplex controlling oncogenic signalling in lymphoma. Nature. , (2018).
